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酶標(biāo)儀工作原理與應(yīng)用
酶標(biāo)儀實(shí)際上就是一臺(tái)變相光電比色計(jì)或分光光度計(jì)，其基本工作原理與主要結(jié)構(gòu)和光電比色計(jì)基本相同. 圖示是一種單通道自動(dòng)進(jìn)樣的酶標(biāo)儀工作原理圖.光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器變成一束單色光，進(jìn)入塑料微孔極中的待測標(biāo)本.該單色光一部分被標(biāo)本吸收，另一部分則透過標(biāo)本照射到光電檢測器上，光電檢測器將這一待測標(biāo)本不同而強(qiáng)弱不同的光信號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號(hào).電信號(hào)經(jīng)前置放大，對(duì)數(shù)放大，模數(shù)轉(zhuǎn)換等信號(hào)處理后送入微處理器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計(jì)算，最后由顯示器和打印機(jī)顯示結(jié)果. 微處理機(jī)還通過控制電路控制機(jī)械驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)X方向和Y方向的運(yùn)動(dòng)來移動(dòng)微孔板，從而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)進(jìn)樣檢測過程.而另一些酶標(biāo)儀則是采用手工移動(dòng)微孔板進(jìn)行檢測，因此省去了X,Y方向的機(jī)械驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)和控制電路，從而使儀器更小巧，結(jié)構(gòu)也更簡單.
微孔板是一種經(jīng)事先包埋專用于放置待測樣本的透明塑料板，板上有多排大小均勻一致的小孔，孔內(nèi)都包埋著相應(yīng)的抗原或抗體，微孔板上每個(gè)小孔可盛放零點(diǎn)幾毫升的溶液.
光是電磁波，波長100nm~400nm稱為紫外光，400nm~780nm之間的光可被人眼觀察到，大于780nm稱為紅外光。人們之所以能夠看到色彩，是因?yàn)楣庹丈涞轿矬w上被物體反射回來。綠色植物之所以是綠色，是因?yàn)橹参镂盏拇蟛糠譃榧t橙光和藍(lán)紫光，但對(duì)綠色不吸收，反射出來，所以植物呈現(xiàn)為綠色。酶標(biāo)儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸光值。
隨著檢測方式的發(fā)展，擁有多種檢測模式的單體臺(tái)式酶標(biāo)儀叫做多功能酶標(biāo)儀，可檢測吸光度(Abs)、熒光強(qiáng)度(FI)、時(shí)間分辨熒光(TRF)、熒光偏振(FP)、和化學(xué)發(fā)光(Lum)。
酶標(biāo)儀從原理上可以分為光柵型酶標(biāo)儀和濾光片型酶標(biāo)儀。光柵型酶標(biāo)儀可以截取光源波長范圍內(nèi)的任意波長，而濾光片型酶標(biāo)儀則根據(jù)選配的濾光片，只能截取特定波長進(jìn)行檢測。
檢測單位
光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。
檢測單位用OD值表示， OD是optical density(光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， OD=log(1/trans)，其中trans為檢測物的透光值。根據(jù)Bouger-amberT-beer法則，OD值與光強(qiáng)度成下述關(guān)系:
E=OD=log(lo/Ι) 其中E表示被吸收的光密度， Ιo 為在檢測物之前的光強(qiáng)度，Ι為從被檢測物出來的光強(qiáng)度。
OD值由下述公式計(jì)算:
c為檢測物的濃度 b為檢測物的厚度 a為摩爾因子
在特定波長下測定每一種物質(zhì)都有其特定的波長，在此波長下，此物質(zhì)能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會(huì)造成檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，在測定檢測物時(shí)，我們選擇特定的波長進(jìn)行檢測，稱為測量波長。
但是每一種物質(zhì)對(duì)光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們?cè)龠x取一個(gè)參照波長，以消除這個(gè)不準(zhǔn)確性。在參照波長下，檢測物光的吸收最小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。
檢測值計(jì)算
儀器中的檢測器接收透過被檢測物的光能量，轉(zhuǎn)換成二進(jìn)位數(shù)字信號(hào)，最大為4095。儀器定義沒有光源下的透光值為 0%，沒有檢測物的透光值為100%。則實(shí)際檢測中，檢測物的透光值均在 0%一100%之間。透光值
的計(jì)算如下:
T=(Meas-Min)/(Max-Min)
其中T為透光值， Meas為檢測的二進(jìn)位數(shù)值， Min為在 0%的情況下檢測的二進(jìn)位數(shù)值， Max為在100%的情況下檢測的二進(jìn)位數(shù)值，舉例如下:
MaX=3600
Min=20
Meas=30
T=(30-20)/3600-20)=0.0028
OD=log(1/T)=log(1/0.0028)=2.552
中心定位
儀器會(huì)自動(dòng)對(duì)酶標(biāo)孔進(jìn)行中心定位，中心定位是要消除酶標(biāo)孔底的凸凹引起的厚薄不均帶來檢測的不準(zhǔn)確。在對(duì)每一個(gè)酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測時(shí)，儀器其實(shí)要進(jìn)行35個(gè)點(diǎn)的測量，選取最中間的5個(gè)點(diǎn)的均值為本孔的OD值。
光源的參照通道
參照通道是用來校準(zhǔn)由于電壓不穩(wěn)或燈泡磨損帶來的影響。
用途和其它提示
用于ELISA試劑的測定，廣泛用于各種實(shí)驗(yàn)室，包括臨床實(shí)驗(yàn)室。
質(zhì)量控制
質(zhì)量控制是試劑檢測的重要因素。請(qǐng)按照試劑說明書的要求進(jìn)行質(zhì)量控制。
空白校正
有一些試劑盒的說明書將空白孔設(shè)置為空氣，其它大多數(shù)空白孔的設(shè)置是用試劑來設(shè)置的，請(qǐng)按照試劑盒的說明書要求進(jìn)行。
檢測結(jié)果的解釋
由于有相當(dāng)多的因素會(huì)影響檢測的結(jié)果，如不同的酶標(biāo)板，檢測試劑的體積，都會(huì)造成OD值的不同，因此，只有使用同一酶標(biāo)板反應(yīng)的試劑檢測結(jié)果才能比較和分析。對(duì)結(jié)果的臨床解釋請(qǐng)依照試劑盒的說明書進(jìn)行.
結(jié)構(gòu)
規(guī)格有24孔板，48孔板，96孔板等多種，不同的儀器選用不同規(guī)格的孔板，對(duì)其可進(jìn)行一孔一孔地檢測或一排一排地檢測.
酶標(biāo)儀所用的單色光既可通過相干濾光片來獲得，也可用分光光度計(jì)相同的單色器來得到.在使用濾光片作濾波裝置時(shí)與普通比色計(jì)一樣，濾光片即可放在微孔板的前面，也可放在微孔板的后面，聚光鏡，光欄后到達(dá)反射鏡，經(jīng)反射鏡作90°反射后垂直通過比色溶液,然后再經(jīng)濾光片送到光電管.
從酶標(biāo)儀工作框圖和光路圖上可看出，它和普通的光電比色計(jì)有以下幾點(diǎn)差異:
(l)盛裝待測比色液的容器不再使用比色皿，而是使用塑料微孔板.微孔板常用透明的聚乙烯材料制成，對(duì)抗原抗體有較強(qiáng)的吸附作用，故用它作為固相載體.
⑵由于盛樣本的塑料微孔板是多排多孔的，光線只能垂直穿過，因此酶標(biāo)儀的光束都是垂直通過待測溶液和微孔板的，光束既可是從上到下，也可以是從下到上穿過比色液.
⑶酶標(biāo)儀通常不僅用A，有時(shí)也使用光密度OD來表示吸光度.酶標(biāo)儀可分為單通道和多通道2種類型，單通道又有自動(dòng)和手動(dòng)2種之分.自動(dòng)型的儀器有X,Y方向的機(jī)械驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)，可將微孔板L的小孔一個(gè)個(gè)依次送入光束下面測試，手動(dòng)型則靠手工移動(dòng)微孔板來進(jìn)行測量.
在單通道酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)上又發(fā)展了多通道酶標(biāo)儀，此類酶標(biāo)儀一般都是自動(dòng)化型的.它沒有多個(gè)光束和多個(gè)光電檢測器，如 12個(gè)通道的儀器設(shè)有 12條光束或 12個(gè)光源，12個(gè)檢測器和12個(gè)放大器，在X方向的機(jī)械驅(qū)動(dòng)裝置的作用下，樣品12個(gè)為一排被檢測.多通道酶標(biāo)儀的檢測速度快，但其結(jié)構(gòu)較復(fù)雜價(jià)格也較高.
用途
可廣泛應(yīng)用于低紫外區(qū)的DNA、RNA定量及純度分析(A260/A280)和蛋白定量(A280/BCA/Braford/Lowry)，酶活、酶動(dòng)力學(xué)檢測，酶聯(lián)免疫測定(ELISAs)，細(xì)胞增殖與毒性分析，細(xì)胞凋亡檢測(MTT)，報(bào)告基因檢測及G蛋白偶聯(lián)受體分析(GPCR)等