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人細小病毒 B19 (HPV B19)核酸檢測試劑盒說明書

閱讀:2014      發布時間:2023-03-02
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人細小病毒 B19 (HPV B19)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)


商品名稱:人細小病毒 B19(HPV B19)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法) 

Name :Human parvovirus B19 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】50T/盒

【預期用途】

人細小病毒 B19(B19)在 1974 年首ci被發現,是細小病毒科(Parvoviridae)中已知的兩種感染人的病毒之一。

B19 病毒在人群中分布廣泛,感染后的臨床癥狀隨宿主的免疫系統和血液狀況的不同而不同,它主要引起兒童的傳染性紅斑和成年人的急性對稱關節炎,也能引發胎兒死亡、胎兒水腫、胎兒先天性貧血。

本試劑盒適用于檢測血液中的人細小病毒,用于人細小病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術,設計一對人細小病毒特異性引物,結合一條特異性探針, 用熒光 PCR 技術對人細小病毒的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規格

50T/盒

HPV B19 反應液

500μL×2 管

酶液

50μL×1 管

HPV B19 陽性質控品   1.25×10^6拷貝/mL

50μL ×1 管

陰性質控品

250μL ×1 管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

抽取全血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h;若需長期保存,應放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.  樣品處理(樣本處理區)

1.1  樣本前處理

取全血或血清 100μL 進行提取。

1.2  核酸提取

推薦采用優利科(上海)生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取,請    按照試劑說明書進行操作。

2.  試劑配制(試劑準備區)

根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:

試劑

HPV B19 反應液

酶液

用量(樣本數為 N)

19μL

1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,20μL/管。

3.  加樣(樣本處理區)

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.  PCR 擴增(核酸擴增區)

4.1  將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;

4.2  設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3  推薦循環參數設置:


 

步驟

循環數

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95℃

2min

2

45 cycles

95℃

15sec

60℃

30sec

5.  結果分析判定

5.1  結果分析條件設定(請參照各儀器使用說明書進行設置,以分析 ABI7500 儀器為例)

反應結束后自動保存結果,根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據實際情況自行調整,Start 值可設在 3~15、End 值可設在 5~20,使閾值線位于擴增曲線指數期,陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2  結果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數增長曲線; 陰性:樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3  質控標準

陰性質控品:無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示;

陽性質控品:擴增曲線有明顯指數增長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

6.   檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;

3. 陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

5. 不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

6. 試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;

7. 本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴格按照說明書進行;

2. 試劑盒內各種組分使用前應自然融化,wan全混勻并短暫離心;

3. 反應液應避光保存;

4. 反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

8. 試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]黃玉. 人細小病毒 B19 非結構蛋白 NS1 核輸出機制研究[D].華中師范大學,2014.

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優利科(上海)生命科學有限公司

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