產品及特點:
諾如病毒(Norwalk Virus)是單股正鏈 RNA 病毒,屬于人類杯狀病毒屬,是一種引起非細菌性急性腸胃炎的病毒,如諾病毒感染性強,以腸道傳播為主,通過口-糞傳播,以污染的水源、食物、貝類、物品、空氣作為主要傳播載體。諾如病毒可分為 G I-G 五個基因群,其中引起人類感染的主要是 G1 和 G2 群。因此快速靈敏診斷具有重要意義。為此本公司開發了本產品,采用RT-PCR 技術檢測疑似感染動物血清或組織中的諾如病毒 G2 型。它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。
3. 產品精心優化且特異性高,引物是根據諾如病毒 G2 型RNA高度保守區設計,不會跟除此之外的其它病毒RNA發生交叉反應。
4. RT-PCR mix 中含上樣染料,擴增反應后可以直接上樣電泳。
5. 本產品足夠50次20μL體系的PCR反應。
6. 本產品只能用于定性實驗,不能用于定量。
7. 本產品只能用于科研。
規格及成分:
成 份 |
A |
B |
C |
D |
E |
使用手冊 |
注:為避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供專一的核酸片段作為陽性對照。
運輸及保存:低溫運輸,-20℃保存,保存期限為12個月。
自備試劑:樣品RNA
使用方法:
一、樣品DNA的制備
1. 如果有N個樣品,必須設置N+2個提取反應,多出的兩個中一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL諾如病毒 G2 型PCR陽性對照(1×10E6拷貝/μL,本試劑盒提供)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對照。
2. 用自選方法純化上述N+2個樣品的DNA。本試劑盒跟市場上大多數細菌DNA提取試劑盒兼容。
二、設置PCR反應(20μL體系)
3. 標記N+4個PCR管,其中N+2個用于上步得到的DNA樣品,額外增加的兩個管一個用于PCR陽性對照,另一個用于PCR陰性對照。按照下表在各PCR管中加入下列成分:
成分/每管 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照 | PCR陽性對照 |
A | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
D | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
制備的N+2個DNA樣品 | 7 μL | - | - |
C | - | 7 μL | - |
E | - | - | 7 μL |
B | 1 μL | 1 μL | 1 μL |
4. 上機進行PCR,PCR反應參數為:
過程 | 溫度 | 時間 |
逆轉錄 | 50℃ | 20 min |
預變性 | 95℃ | 10 min |
PCR反應 (45個循環) | 95℃ | 30 sec |
55℃ | 60 sec | |
72℃ | 60 sec | |
延伸 | 72℃ | 7 min |
三、電泳分析
1. 取5-10uL擴增產物進行常規瓊脂糖電泳,檢測擴增效果,由于擴增產物較短,建議用1.5%-2.0%的瓊脂糖凝膠。
2. 陽性樣品預期得到的擴增產物長度為220bp左右。如果兩個陰性對照(樣品制備陰性對照或PCR陰性對照)有此擴增產物,說明環境污染,則整個實驗無效,不需要分析實驗結果。
3. 如果所有樣品和PCR陽性對照均無此擴增產物,則說明有系統性的問題(試劑、設備、程序、操作等),需要重復并排查原因。
4. 如果沒有上述兩種情況,則實驗有效,可以分析樣品的擴增結果。N+2個樣品中有擴增產物的判定為陽性,無則判定為陰性。
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