細胞介紹
細胞持續表達SV40抗原,該細胞常用于轉染實驗,轉染效率較高。(轉染一般以50%密度鋪板,待細胞剛剛貼到皿壁上后(一般8-10小時),即可進行轉染操作)
細胞特性
1) 來源:人胚胎腎臟
2) 形態:上皮細胞樣,貼壁生長,貼壁能力較弱
3) 含量:>1x106 細胞數
4) 規格:T25瓶或者1mL凍存管包裝
5) 用途:僅供科研使用。
運輸和保存:干冰運輸及復蘇好存活細胞:(1)1mL凍存管包裝干冰運輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇,若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染,請立即與我們聯系。(2)T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨,收到后按照細胞接收后的處理方法操作。
細胞接收后的處理:
1)收到細胞后,75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h,若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染,請拍照后及時聯系我們。
2)請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態,同時給剛收到的細胞拍照(10×,20×)各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存,作為售后時收到時細胞狀態的依據。
3)半貼細胞和貼壁不牢(懸浮)細胞:T25瓶置于37℃培養箱中約2-3h,顯微鏡下觀察細胞的情況,若細胞密度在60%以下,客戶需收集T25瓶中的懸浮細胞離心后用wan全培養基重懸后打回到原培養瓶中繼續培養,若細胞生長70%-90%對細胞進行傳代,傳代時需要收集培養基中懸浮的細胞離心后回收。
4)備注:運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞,請換用按照說明書細胞培養條件新配制的wan全培養基來培養細胞。 收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1:2傳代 。
一.培養基及培養凍存條件準備:
1) 準備DMEM(培養基;優質胎牛血清,10%;L-谷氨酰胺(2mM)1%;NEAA 1% ; 雙抗 1%
注意:1.該細胞貼壁能力較弱,培養時可酌情使用預鋪0.2%明膠的培養瓶/培養皿。wan全培養液中需添加熱滅活胎牛血清。細胞生長不能過密,過密細胞容易脫落,脫落下來的細胞可以通過離心收集,使用0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA 消化后繼續培養。
2.如果發生293T細胞不貼壁,漂浮在培養基中的現象,請確認所使用的DMEM中碳酸氫鈉濃度及培養箱中CO2濃度。并參考以下培養體系:
a) DMEM由1.5 g/L碳酸氫鈉配制而成,使用5%CO2培養箱。
b) DMEM由3.7 g/L碳酸氫鈉配制而成,使用10%CO2培養箱。
當使用碳酸氫鈉含量高的培養基時,必須將這些細胞在10%CO2中孵育,以便正確緩沖培養基。當培養基沒有適當緩沖時,239T細胞雖然可以存活,但將無法粘附并保持漂浮在培養基中。
2) 培養條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養箱濕度為70%-80%。
3) 凍存液:90%FBS,10%DMSO,現用現配。
二. 細胞處理:
1)凍存細胞的復蘇:
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4-6mLwan全培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,wan全培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8mlwan全培養基的培養瓶(或皿)中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2) 細胞傳代:如果細胞密度達70%-90%,即可進行傳代培養。
該細胞為懸浮和輕微的貼壁細胞,傳代可以參考以下方法:
1. 收集:將培養瓶中的懸浮的細胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。由于細胞貼壁不牢PBS潤洗后細胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。
2. 加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL)置于37℃培養箱中消化1-2分鐘(難消化的細胞可以適當延長消化時間),然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。
3. 將收集到的懸浮細胞、pbs清洗液中的細胞和消化下來的貼壁細胞以1000rpml離心5min,棄去上清,補加1-2mL培養液后重懸混勻后將細胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的wan全培養基以保持細胞的生長活力,后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3) 細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。下面T25瓶為例;
1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中,可使用血球計數板計數,來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.
2. 1000rpm離心3-5min,去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ,按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中,標注好名稱、代數、日期等信息。
3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中,-80度冰箱中過夜,之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。
注意事項:
1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級生物安全臺內操作,并請注意防護,所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意:凍存管浸沒在液氮中會泄漏,并會慢慢充滿液氮。解凍時,液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,從而產生飛揚的碎屑造成人員傷害。
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