牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
【產品名稱】
商品名稱：牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）
Name： Bovine Viral Diarrhea Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測的牛的組織樣品、鼻拭子等標本中牛病毒性腹瀉病毒核酸，適用于牛病毒性腹瀉病毒 感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對牛病毒性腹瀉病毒特異性引物，結合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術對牛病毒性腹瀉病毒的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。
【試劑組成】
包裝規格 | 50T/盒 |
BVDV 反應液 | 500μL×2 管 |
酶液 | 50μL×1 管 |
BVDV 陽性質控品 | 50μL ×1 管 |
陰性質控品 | 250μL ×1 管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
組織樣品：用無菌剪刀、鑷子采集待檢臟器或組織。可采集腸粘膜刮取物或肺、脾、淋巴結等作為待檢組織樣品；對流產胎牛、死胎，直接采集胎兒的組織；對懷疑死于粘膜病的牛，可采集xue塊或肺、脾、淋巴結等組織，尤其是腸道集合淋巴組織，如腸道樣品已發生自溶，可采扁桃體和淋巴結。將采集的樣品裝入無菌采樣袋或其他滅菌容器，編號備用；鼻拭子：對疑似為急性感染期或持續感染的牛，采集鼻分泌物拭子。取鼻拭子時將拭子深入鼻腔來回擦拭 2 次~3 次并旋轉，取分泌物；將采樣后的拭子放入盛有 2.0 mL PBS 的采樣管中，編號備用。
其它樣本采集請參考 GB/T 18637-2018 《牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術規范》。
【保存和運輸】
采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1 樣本前處理
組織樣品：用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品 2.0g 于研缽或組織勻漿器中充分研磨，再加 10.0mLPBS 混勻，
2000r/min 離心 5 min 后，取 1.0ml 上清液轉入無菌 1.5mL 滅菌離心管中，編號備用。
鼻拭子：用含 1000U/mL 青霉素和鏈霉素的細胞培養液 4 倍稀釋后，2000r/min 離心 15min 取上清液，編號備用。
其他樣本前處理請參考 GB/T 18637-2018 《牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術規范》。
1.2 核酸提取
推薦采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按 照試劑說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿
10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | BVDV 反應液 | 酶液 |
用量（樣本數為 N） | 19μL | 1μL |
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4. PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇
ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3 推薦循環參數設置：
步驟 | 循環數 | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 50℃ | 10min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 2min | 否 |
3 | 45 cycles | 95℃ | 15sec | 否 |
60℃ | 30sec | 是 |
5. 結果分析判定
5.1 結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）
反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。
5.2 結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。
5.3 質控標準
陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
6. 檢測方法的局限性
1. 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
3. 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
4. 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
6. 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
7. 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
1. 所有操作嚴格按照說明書進行；
2. 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；
3. 反應液應避光保存；
4. 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8. 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1] 中華人民共和國農業農村部(2018).GB/T 18637-2018.國家市場監督管理總局;中國國家標準化管理委員會.
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