【產品名稱】
通用名稱：牛腺病毒3型(BAV-3)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
Name ：Bovine Adenovirus Detection Kit（Real-Time PCR Method）
【包裝規格】48T/盒
【預期用途】
牛腺病毒3型（BAV-3）是引起牛呼吸道疾病的主要病原體之一，特別是新生犢牛。臨床癥狀包括發燒，呼吸困難，鼻腔和眼結膜有分泌物等。病理變化主要舉行阿玉肺部，具有鮮明的肺小葉wei縮、肺氣腫和突變。血清學調查表明該病廣泛分布于世界各地，給養牛業造成巨大經濟損失。
本試劑盒適用于檢測肺組織、呼吸道及眼鼻分泌物等樣本中的牛腺病毒3型，用于牛腺病毒3型感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，根據牛腺病毒3型基因保守區設計特異性引物和探針，用熒光PCR技術對牛腺病毒3型的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規 格 |
核酸提取液 | 1.5mL×2管 |
酶液 | 50μL×1管 |
BAV-3反應液 | 1.0mL×1管 |
BAV-3陽性質控品 | 50μL×1管 |
陰性質控品 | 250μL×1管 |
注：不同批號試劑不能混用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
捕殺牛：取肺部病變組織，5g；活牛：用滅菌棉拭子沾取牛氣管或眼鼻分泌物，然后置于裝有0.5mL生理鹽水的離心管中。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1 樣本前處理
組織樣品：稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；棉拭子：直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。
1.2 DNA提取
1) 對上述處理好的標本加入50μL核酸提取液，100℃恒溫處理10min，13,000 rpm離心5min，取上清液轉移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；
2) DNA的提取也可以采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的DNA提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | BAV-3反應液 | 酶液 |
用量（樣本數為N） | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應液分裝到PCR反應管中，21uL/管。
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
4.3 推薦循環參數設置：
步驟 | 循環數 | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結果分析判定
5.1 結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.1 結果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線；
可疑：檢測通道35<Ct值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為35<Ct值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結果Ct值>38或無Ct值。
6. 質控標準
陰性質控品：Ct>38或無Ct值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行；
? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；
? 反應液應避光保存；
? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1] 于作. 牛腺病毒3型中國分離株的鑒定及全基因組序列分析[J]. 中國農業科學院, 2011.
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