轉基因植物NOS 終止子核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
【產品名稱】
通用名稱：轉基因植物 NOS 終止子核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name ：tNOS Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】
根農桿菌煙脂堿合成酶基因終止子（tNOS）是轉基因作物常用到的元件之一， 到目前為止，43%的轉基因作物含有 NOS 終止子。熒光 PCR 技術因其靈敏度高、特異性強等特點，在轉基因檢測中發揮了重要作用。
本試劑盒適用于檢測轉基因植物的 NOS 終止子基因，用于篩查待檢測植物中是否含有 NOS 成分。。
【檢驗原理】
本試劑盒根據 NOS 終止子序列設計特異性引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術進行轉基因成分的檢測。
【試劑組成】
名 稱 | 規 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
tNOS 反應液 | 500μL×2 管 |
tNOS 陽性質控品 | 50μL ×1 管 |
陰性質控品 | 250μL ×1 管 |
注：
1） 不同批號試劑不能混用。
2） 試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
【儲存條件及有效期】
-20℃避光保存、運輸、反復凍融不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
稱取 200g 樣品。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 0℃冰壺。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1 樣本前處理
固體樣本：用粉碎機或冷凍研磨儀將樣品研磨至細粉狀。
1.2 DNA 提取
推薦采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取
法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | tNOS 反應液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴增（核酸擴增區）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25ul；熒光通道選擇： 檢測通道
（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3 推薦循環參數設置：
步驟 | 循環數 | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結果分析判定
5.1 結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2 結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線；
可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值
≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6. 質控標準
陰性質控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或 定量檢測不準確的結果；
? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行；
? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；
? 反應液應避光保存；
? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全 通則》進行處理。.
【參考文獻】
[1] 中國農業部. 1782 號公告-3-2012 轉基因植物及其產品成分檢測調控元件CamV 35S 啟動子、FMV 35S 啟動子、NOS 啟動子、NOS 終止子和 CaMV 35S 終止子定性 PCR 方法[S]. 北京: 科學出版社, 2012.
[2] 徐俊鋒, 王鵬飛, 李玥瑩, 等. 轉基因植物中CaMV35S 和tNOS 元件的 4 種定性PCR 檢測方法的比較. 農業生物技術學報, 2015 , 23 (3) :397-407.
[3] 周建嫦, 楊明杰, 楊杏芬. PCR 法檢測食品和動物飼料中的轉基因成分[J]. 衛生研究, 2005 , 34 (6) :732-735.
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