魚類神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:魚類神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name :Viral Nervous Necrosis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
魚病毒性神經(jīng)壞死病又稱為病毒性腦病和視網(wǎng)膜病,是一種嚴(yán)重危害魚類魚苗的病毒性疾病。病原為病毒性神經(jīng)壞死病毒(Viral nervous necrosis virus, VNNV),屬乙型野田村病毒屬成員[1]。其臨床癥狀為一系列與神經(jīng)有關(guān)的異常表現(xiàn)。魚苗具不正常的螺旋狀或旋轉(zhuǎn)式游動或靜止時腹部朝上,一旦用手觸碰病魚,病魚會立即游動等現(xiàn)象,魚體體色異常蒼白。不同種類的魚臨床癥狀不同,有的魚苗會出現(xiàn)鰾過度膨脹,有的病魚厭食、消瘦等。發(fā)病嚴(yán)重的魚苗伴隨著ji高的死亡率[1-2]。
本試劑盒適用于檢測的魚的腦、眼等標(biāo)本中魚類神經(jīng)壞死病毒 RNA,適用于魚類神經(jīng)壞死病毒感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒對魚類神經(jīng)壞死病毒基因設(shè)計特異性的引物和探針[2-3],用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對魚類神經(jīng)壞死病毒RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
VNN 反應(yīng)液 | 500μL×2 管 |
VNN 陽性質(zhì)控品 | 50μL ×1 管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL ×1 管 |
注:
1) 不同批號試劑不能混用。
2) 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列
熒光定量 PCR 檢測儀。
【標(biāo)本采集】
取魚類的腦和眼,魚苗和較小的仔魚取整條魚。
【保存和運輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標(biāo)
本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中, 8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2 RNA 提取
推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒(離心柱提取法),
請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 | VNN 反應(yīng)液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;熒光通道選擇:
檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 42℃ | 20min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
3 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;
可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤ 38,且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時滿足,否則實驗視為無效。
7. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
? 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;
? 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
? 不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
? 試劑運輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;
? 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,wan全混勻并短暫離心;
? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全 通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 陳愛平, 江育林, 錢冬, 等. 病毒性神經(jīng)壞死病[J]. 中國水產(chǎn), 2010.
[2] 中國農(nóng)業(yè)部. SC/T 7216-2012 魚類病毒性神經(jīng)壞死病(VNN)診斷技術(shù)規(guī)程[S]. [3]羅衛(wèi). 魚類病毒性神經(jīng)壞死病的病原學(xué)研究及檢測方法的建立[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.
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