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苯胺-4-羥化酶(AH)活性測定試劑盒說明書

閱讀:329      發布時間:2023-03-29
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苯胺-4-羥化酶AH活性測定試劑盒說明書

                                                  微量法100/48

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,在外源物質代謝中具有重要作用,尤其是藥物和毒物的代謝。AHP450酶系中相當于CYP2E1亞型,CYP2E1不僅參與了藥物的代謝,而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。

 

測定原理:

AH催化苯胺羥化后產生的4-氨基酚,進一步轉變為酚-吲哚復合物,在630nm處有特征吸收峰;通過測定630nm吸光度增加速率,來計算AH活性。

 

自備儀器及用品:

普通離心機、超速離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、雙蒸水和冰。

 

試劑組成和配制:

試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入100mL蒸餾水,充分溶解。

試劑二:液體×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入10mL蒸餾水,充分溶解。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水,充分溶解。

試劑五:液體×1瓶,4℃保存。

試劑六:粉劑×1瓶(腐蝕性試劑),4℃避光保存。臨用前加入10mL蒸餾水,充分溶解。

試劑七:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入10mL蒸餾水充分溶解。

標準液:液體×1瓶,10μmol/L,4℃避光保存。

 

粗酶液提取:

1、除去細胞核,線粒體等大分子物質:稱約0.5g組織,加入1mL試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4℃,離心30min,取上清液,轉移到超速離心管中。

2、粗制微粒體: 100 000g 4℃,離心60min,棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質:向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。

4、最終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL,蓋緊后充分震蕩溶解,即粗酶液,待測。

 

測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到630 nm,蒸餾水調零。

2. 試劑三置于37℃水浴中預熱30min。

3. 試劑五置于冰浴預冷30min。

4. 標準管:0.5 mL EP管,加入100μL標準液,100μL試劑六,100μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,630 nm測定光吸收,記為A標準管。

 

5. 對照管:0.5 mL EP管,加入50μL粗酶液,100μL試劑三,50μL蒸餾水,混勻后37℃水浴中保溫30min;再加入100μL試劑五,混勻后冰浴5min11000rpm,4℃,離心10min;取100μL上清液,加入新的0.5 mL EP管;再加入100μL試劑六,100μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,630 nm測定光吸收,記為A對照管。

6. 測定管:取0.5 mL EP管,加入50μL粗酶液,100μL試劑三,50μL試劑四,混勻后37℃水浴中保溫30min;再加入100μL試劑五,混勻后冰浴5min11000rpm4℃,離心10min;取100μL上清液,加入新的0.5 mL EP管;再加入100μL試劑六,100μL試劑七,混勻后室溫靜置30min,吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,630 nm測定光吸收,記為A測定管。

 

AH活性計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按蛋白濃度計算

活性單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產生1nmol 4-氨基酚1個酶活單位。

AH活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷Cpr×V樣)÷T

= 2×A測定管-A對照管)÷A標準管÷Cpr

2)按樣本質量計算

活性單位定義:37中每克樣本每分鐘催化產生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。

AH活性(nmol/min/g 鮮重)= C標準品×V標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(W×V)÷T

= 2×A測定管-A對照管)÷A標準管÷W

C標準品:10μmol/LV標準品:100μL=1×10-4L;稀釋倍數: V反總÷V上清液=300μL÷100μL=3;Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;W 樣品質量;V樣:加入反應體系中粗酶液體積, 50μL=0.05 mL T:催化反應時間(min),30min

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1)按蛋白濃度計算

活性單位定義:37中每毫克蛋白每分鐘催化產生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。

AH活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷Cpr×V樣)÷T

= 2×A測定管-A對照管)÷A標準管÷Cpr

2)按樣本質量計算

活性單位定義:37中每克樣本每分鐘催化產生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。

AH活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(W×V)÷T

= 2×A測定管-A對照管)÷A標準管÷W

C標準品:10μmol/LV標準品:100μL=1×10-4L;稀釋倍數:V反總÷V上清液=300μL÷100μL=3;Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒; W 樣品質量; V樣:加入反應體系中粗酶液體積, 50μL=0.05 mL; T:催化反應時間(min),30min。

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