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半胱氨酸(cysteine, Cys)含量測定試劑盒

閱讀:304      發布時間:2023-03-30
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半胱氨酸(cysteine, Cys)含量測定試劑盒說明書

                                                  微量法100T/96S

   正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

蛋白質含有三種含硫氨基酸:甲硫氨酸胱氨酸Cys。其中,Cys是唯yi一種含有巰基的含硫氨基酸,從甲硫氨酸轉化而來,并且可與胱氨互相轉化。Cys參與蛋白質二硫鍵的形成,經常是蛋白質活性中心的組成部分,還可以為其它生理生化反應提供巰基。此外,Cys大量積聚在皮膚和粘膜表面,在角蛋白生成中維持重要的巰基酶的活性,并且補充巰基,以維持皮膚的正常代謝,調節表皮最下層的色素細胞生成的底層黑色素。具有美白、解毒、改善炎癥和過敏性皮膚等作用。

 

測定原理:

Cys還原磷鎢酸生成鎢藍,在600nm處有吸收峰;通過600nm吸光度,計算Cys含量。

自備儀器和用品:

低溫離心機、可調式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、85磷酸和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。用前1天,向試劑三中加2.5mL蒸餾水充分溶解,再加85%磷酸0.625mL,混勻后蓋緊(防止水分散失)沸水浴2h;冷卻后加10mL蒸餾水,4℃可保存2周。

標準品:粉劑×1瓶,臨用前加10 mL蒸餾水,充分溶解。1μmol/mL標準液,4℃避光保存。用不完的試劑4℃可保存3天。

 

半胱氨酸提取:

1、   液體樣品中半胱氨酸提取:取0.1mL液體樣品,加試劑一0.9mL,充分混勻,8000g

4離心10min,取上清液,待測。

2、   組織中半胱氨酸提取:按照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿8000g 4離心10 min,取上清液待測。

3、   細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到600 nm,蒸餾水調零。

2. 空白管:取微量石英比色皿/96孔板,加入20μL蒸餾水,100μL試劑二,100μL試劑三,混勻后室溫靜置15 min,于600nm處測定吸光值,記為A空白管。

3. 標準管:取微量石英比色皿/96孔板,加入20μL標準液,100μL試劑二,100μL試劑三,混勻后室溫靜置15 min,于600nm處測定吸光值,記為A標準管。

 

4. 測定管:取微量石英比色皿/96孔板,加入20μL上清液,100μL試劑二,100μL試劑三,混勻后室溫靜置15 min,于600nm處測定吸光值,記為A測定管。

注意:空白管和標準管只需要做一次。

 

計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1. 按液體樣品的體積計算:

半胱氨酸含量(μmol/mL=[C標準品×V標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V樣總÷V樣)=1×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

2. 按樣本質量計算:

半胱氨酸含量(μmol/g 鮮重)=[C標準品×V標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V樣總÷V樣)÷W=1×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

3. 按照蛋白濃度計算:

半胱氨酸含量(μmol /mg prot= [C標準品×V標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]÷V×Cpr=1×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

4. 按細胞數量計算:

氨基酸含量(μmol /104 cell=[C標準品×V標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)] ×V樣總÷V×細胞數量)=1×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數量

C標準品:標準品濃度,1 μmol/mLV標準品:反應體系中加入標準品體積,0.02mLV樣:反應體系中加入樣品提取液體積,0.02 mLV樣總:樣品提取液,1mLW:樣品質量,g

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1. 按液體樣品的體積計算:

半胱氨酸含量(μmol/mL=[C標準品×V標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V樣總÷V樣)=1×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

2. 按質量計算:

半胱氨酸含量(μmol/g 鮮重)=[C標準品×V標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V樣總÷V樣)÷W=1×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

3. 按照蛋白濃度計算:

半胱氨酸含量(μmol /mg prot= [C標準品×V標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]÷V×Cpr=1×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

4. 按細胞數量計算:

氨基酸含量(μmol /104 cell=[C標準品×V標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)] ×V樣總÷V×細胞數量)=1×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數量

C標準品:標準品濃度,1 μmol/mLV標準品:反應體系中加入標準品體積,0.02mLV樣:反應體系中加入樣品提取液體積,0.02 mLV樣總:樣品提取液,1mLW:樣品質量,g

注意事項:

最di檢出限為100μmol/L

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優利科(上海)生命科學有限公司

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