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谷氨酰胺合成酶(GS)試劑盒說明書

閱讀:361      發布時間:2023-03-30
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谷氨酰胺合成酶Glutamine synthetaseGS試劑盒說明書

                                       微量法 100/48

 

   意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

GSEC 6.3.1.2主要存在于植物中,是生物體內氨同化的關鍵酶之一,催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺,不僅可以防止過多的銨離子對生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要儲存和運輸形式。

 

測定原理

GSATPMg2+存在下,催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺進一步轉化為γ─谷氨酰基異羥肟酸,在酸性條件下與鐵形成的絡合物在540nm處有最大吸收峰,可用分光光度計測定。

所需的儀器和用品

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

提取液:100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:10mL×1瓶,-20℃保存;臨用前37℃預熱20min充分混勻,如有沉淀,靜置10min,取上清待用。

試劑二:10mL×1瓶,-20℃保存;臨用前37℃預熱20min,充分混勻,如有沉淀,靜置10min,取上清待用。

試劑三:粉劑×2瓶,-20℃保存。用時每瓶加入5mL蒸餾水充分溶解待用。

試劑四:15mL×1瓶,4℃保存。

 

樣本測定的準備

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至540nm,蒸餾水調零。

2、   EP管中加入下列試劑:

試劑名稱(μL

測定管

對照管

試劑一

160


試劑二


160

試劑三

70

70

樣本

70

70

  混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其他物種)準確水浴30min

試劑四

100

100

混勻,25℃室溫靜置10min后,8000g25℃離心10min,取200μL上清液至微量石英比色皿或96孔板中,測定540nm處的吸光值A△A=A測定管-A對照管。每個測定管需設一個對照管。

 

 

GS活力單位的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線:y = 0.8348x + 0.0008R2 = 0.9999

1、血清(漿)GS活性

單位定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。

計算公式:

GSμmol/h/mL=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷V÷T

=10.268×ΔA

2、組織、細菌或細胞GS活性

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。

GSμmol/h/mg prot=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(Cpr×V)÷T

=10.268×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。

GSμmol/h/g 鮮重)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(W× V÷V樣總)÷T

 =10.268×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。

GSμmol/h//104 cell=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(500×V÷V樣總)÷T

=0.021×ΔA

V反總:反應體系總體積,0.3mL V樣:加入樣本體積,0.07mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,30 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

標準曲線:y = 0.4174x + 0.0008R2 = 0.9999

1、血清(漿)GS活性

單位定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。

計算公式:

GSμmol/h/mL=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷V÷T

=20.535×ΔA

 

2、組織、細菌或細胞GS活性

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。

GSμmol/h/mg prot=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷(Cpr×V)÷T

=20.535×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。

GSμmol/h/g 鮮重)=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷(W× V÷V樣總)÷T

 =20.535×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。

GSμmol/h/104 cell=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷(500×V÷V樣總)÷T

 =0.041×ΔA

V反總:反應體系總體積,0.3mL V樣:加入樣本體積,0.07mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,30 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

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