鳥氨酸轉氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
脯氨酸是植物體內適應逆境脅迫的一種重要的滲透調節物質。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥氨酸轉氨酶( δ-OAT) 是 是以鳥氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關鍵酶,對植物適應逆境脅迫起關鍵作用。
測定原理:
鳥氨酸和α-酮戊二酸在鳥氨酸轉氨酶和NADH作用下發生氨基轉移反應生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同時產生NAD,通過檢測340nm處的吸光度的變化可反映出鳥氨酸轉氨酶活性的高低。
自備實驗用品及儀器:
天平、低溫離心機、研缽、酶標儀、96孔板。
試劑組成和配制:
提取液:液體110mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體30 mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加8mL試劑一充分溶解;用不完的試劑4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加8mL試劑一充分溶解;用不完的試劑4℃保存。
試劑四:粉劑×2瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加4mL試劑一充分溶解;現配現用。
酶液提取:
1. 組織:按照質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。
2. 細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。
3. 液體:直接檢測。
測定操作:
1. 酶標儀預熱30min,調節波長至340nm。
2. 將配好的試劑二、三、四37℃預熱5min。(注意:粉劑試劑需要自行配制)
3. 取96孔板,依次加入60μL試劑二,60μL試劑三,60μL試劑四,20μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm處初始吸光值和37℃反應10min的吸光值A2,△A=A1-A2。
4. 計算公式:
用96孔板測定的計算公式如下:
(1)按照樣本蛋白濃度計算
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
δ-OAT(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T
=321.54×ΔA÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
酶活單位定義:每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
δ-OAT(nmol/min /g 鮮重)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T
=321.54×ΔA÷W
(3)按照細胞數量計算
酶活單位定義:每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
δ-OAT(nmol/min /104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T
=321.54×ΔA÷細胞數量
(4)按照液體體積計算
酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
δ-OAT(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷V樣÷T
=321.54×ΔA
V反總:反應體系總體積,0.2mL;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g
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