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脯氨酸(PRO)含量測定試劑盒說明書

閱讀:418      發布時間:2023-04-03
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脯氨酸(PRO)含量測定試劑盒說明書

                                         微量法100/96

 

  正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

Pro廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,逆境條件下,植物體內Pro含量顯著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性,抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸。因此,脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標之一。

 

測定原理:

用磺基水楊酸(SA)提取Pro,加熱處理后,Pro與酸性茚三酮溶液反應生成紅色;加甲苯萃取后,在520nm測定吸光度。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、冰乙酸25mL、甲苯50mL、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存。

試劑一:冰乙酸25 mL×1瓶, 4保存。(自備)

試劑二:液體25 mL×1瓶, 4保存。

試劑三:甲苯50mL×1瓶,4保存。(自備)

 

樣品測定的準備:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);之后置90℃振蕩提取10min10000g25℃離心10min,取上清,冷卻后待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿;之后置90℃振蕩提取10min10000g25℃離心10min,取上清,冷卻后待測。

2、血清(漿)樣品:按照血清(漿)體積(mL):提取液體積(mL)15~10的比例(建議0.1mL血清(漿)加入1mL提取液),充分混勻,之后置90℃浴振蕩提取10分鐘,10000g25離心10分鐘,取上清,冷卻后待測。

 

測定步驟:

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至520nm,蒸餾水調零。

2、   樣本測定:

(1) 0.25mL樣本+0.25mL試劑一+0.25mL試劑二 于有蓋EP管中,置沸水浴中保溫30min(蓋緊,防止水分散失),每10min振蕩一次。

 

(2) 待冷卻后,加入0.5mL試劑三,振蕩30s,靜置片刻,使色素轉至試劑三中;吸取0.2mL上層溶液于微量石英比色皿或96孔板中,于520nm波長處比色,記錄吸光A

 

Pro含量計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、典型回歸方程y = 0.0521x - 0.0021  (x為脯氨酸含量,μg/mLy吸光A)

2、按照血清(漿)體積計算

Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質量計算

Pro含量(µg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照細菌或細胞密度計算

Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)

V1:加入反應體系中樣本體積,0.25mLV2:加入提取液體積,1 mLV3:加入血清(漿)體積,0.1 mLCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

b.96孔板測定的計算公式如下

1、典型回歸方程y = 0.02605x - 0.0021  (x為脯氨酸含量,μg/mLy吸光A)

2、按照血清(漿)體積計算

Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2=384×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質量計算

Pro含量(µg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W

3、按照細菌或細胞密度計算

Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)

V1:加入反應體系中樣本體積,0.25mLV2:加入提取液體積,1 mLV3:加入血清(漿)體積,0.1 mLCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

注意:Z低檢測限為1μg/mL

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優利科(上海)生命科學有限公司

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