羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
HYP是機體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標。
測定原理：
樣品經水解產生游離的HYP，進一步被氯胺T氧化，氧化產物與對二甲氨基苯jia醛反應，產生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560nm吸光值，可計算HYP含量。
自備實驗用品及儀器：
天平、烘箱、玻璃管、離心機、水浴鍋、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、無水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。
試劑組成和配制：
組織提取液：6mol/L鹽酸，自備。濃鹽酸：H2O（V/V）= 1:1，室溫保存。
細胞提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
羥脯氨酸提取：
1. 組織：稱取約0.2g樣品于玻璃管，加入2mL的組織提取液，置于110℃烘箱，水解6至12小時，用提取液定容至2mL，12000g，25℃，離心20min，取上清待測。
2. 細胞：取約500萬個細胞，加入1mL的細胞提取液，于高壓消毒器中15磅保持30min，自然降壓后待測。
3. 血清游離羥脯氨酸提取：取0.1mL血清，加入0.5mL無水乙醇使蛋白質沉淀，8000g4℃離心5min。將上清倒入另一個EP管，氮吹或沸水浴將乙醇揮發干。冷卻后再加入0.2mL50%異丙醇，充分溶解混勻待測。
測定操作表：
1、 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長至560nm，蒸餾水調零。
2、 操作表
對照管 | 測定管 | |
樣本（µL） | 60 | |
試劑一（µL） | 60 | 60 |
混勻，室溫靜置20min | ||
試劑二（µL） | 60 | 60 |
H2O（µL） | 180 | 120 |
混勻，60℃，20min，取出后25℃靜置15 min，取200µL于微量石英比色皿/96孔板中檢測560nm處吸光值。ΔA=A測定-A對照 | ||
羥脯氨酸含量計算公式：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按樣品重量計算
組織羥脯氨酸含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.154×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按細菌或細胞密度計算
細胞羥脯氨酸含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷V樣×V樣總÷細胞數量（萬個）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 細胞數量（萬個）
（3）按血清體積計算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V反總÷V樣×2
=0.154×（ΔA-0.0251）
V反總：反應總體積，0.3 mL；V樣：反應中樣品體積，0.06mL；V樣總：加入提取液體積， mL；W：樣本重量，g
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y=32.4375x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按樣品重量計算
HYP含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.308×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按細菌或細胞密度計算
HYP含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×V樣總÷細胞數量（萬個）= 0.154×（ΔA-0.0251）÷細胞數量（萬個）
（3）按血清體積計算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×2
= 0.308×（ΔA-0.0251）
V反總：反應總體積，0.3 mL；V樣：反應中樣品體積，0.06mL；V樣總：加入提取液體積， mL；W：樣本重量，g；2，血清吹干后復溶的倍數。
注意事項：
1、 吸光值大于0.8，樣品適當稀釋再測定，注意計算公式里乘以稀釋倍數。
2、 試劑有一定的毒性，請操作時做好防護措施，防止吸入或與皮膚接觸。
3、 Z低檢出限為3.8mg/L。
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