BCA法蛋白含量測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定
測定意義:
樣品可溶性蛋白質含量常常用于酶活性計算。此外,可溶性蛋白質含量也用于食品等質量分析。
測定原理:
堿性條件下,蛋白質中半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及肽鍵,能將Cu2+還原成Cu+;2分子的BCA與Cu+結合,生成紫色絡合物,在540-595nm有吸收峰,562nm處吸收峰Z強。
自備儀器和用品:
臺式離心機、恒溫水浴鍋、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑A:液體25mL×1瓶,4℃保存。
試劑B:液體0.5mL×1支,4℃保存。
標準品:液體2mL×1支,4℃保存。
工作液配制:臨用前請根據擬用工作液體積(樣本數×0.2mL),將試劑A和B按照50:1的比例混合,蓋緊后充分混勻。
樣品中可溶性蛋白質提取:
1. 液體樣品:澄清液體樣品可以直接測定。
2. 組織樣品:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液(自備,根據需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水)
冰浴勻漿,10000rpm,4℃離心10min,取上清,即待測液。
3. 細菌、細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000rpm,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
測定操作:
1. 可見分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到562 nm,蒸餾水調零。
2. 工作液置于60℃水浴預熱30 min。
空白管 | 標準管 | 測定管 | |
蒸餾水(μL) | 4 | ||
標準品(μL) | 4 | ||
待測液(μL) | 4 | ||
工作液(μL) | 200 | 200 | 200 |
混勻后置于60℃保溫30min,于微量玻璃比色皿/96孔板,于562nm處測定吸光值A,分別記為A空白管、A標準管、A測定管。 |
注意:空白管和標準管只需要做一次。
計算公式:
Cpr (mg/mL)= C標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)
=0.5×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)
Cpr (mg/g 鮮重)= C標準品×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)÷ W
=0.5×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)÷ W
W: 樣本質量,g
注意事項:
BCA法蛋白含量測定試劑盒,適用于測定蛋白濃度在20-5000μg/ml樣品。測定前取1-2個樣做預實驗,若A測定管-A空白管﹥1.5,需將樣本用提取液稀釋后再測定,以確保測定的準確性。
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