考馬斯亮藍法測蛋白含量測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
樣品可溶性蛋白質含量常常用于酶活性計算。此外,可溶性蛋白質含量也用于食品等質量分析。
測定原理:
在酸性溶液中,考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合形成藍色復合物;該復合物在620nm處有最大吸收峰, 其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。該方法靈敏度高,適合微量蛋白質分析。
自備儀器和用品:
離心機、酶標儀、96孔板、移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體11 mL×1瓶,4℃保存。
樣品中可溶性蛋白質提取:
1. 液體樣品:澄清液體樣品可以直接測定。
2. 組織樣品:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:20的比例(建議稱取約0.05 g組織,加入1mL提取液(自備,根據需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水))
冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即待測液。(動物樣品常常需要稀釋)
3. 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
測定操作:
1. 酶標儀預熱30 min。
2. 在96孔板中加入:
試劑(μL) | 測定管 | 空白管 |
樣本 | 100 | |
蒸餾水 | 100 | |
試劑一 | 100 | 100 |
混勻后,測定波長620 nm吸光值,△A=A測定-A空白。 |
注意:空白管只需要測定一次。
計算公式:
標準曲線:y = 7.1265x - 0.0007 R2 = 0.9997 x: 蛋白標準品濃度(mg/mL)
y: 吸光值差值
1.按液體樣本體積計算:
Cpr(mg/mL)=(△A+0.0007)÷7.1265
=0.1403×(△A+0.0007)
2.按組織樣本質量計算:
Cpr(mg/g)=(△A+0.0007)÷7.1265×V總÷W
=0.1403×(△A+0.0007)÷W
V總:提取液體積,1 mL; W:樣本質量,g。
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