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酸性蛋白酶(Acid protease, ACP)試劑盒說明書

閱讀:366      發(fā)布時間:2023-04-04
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酸性蛋白酶(Acid protease, ACP)試劑盒說明書

                                              微量法100T/48S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

ACP是一種在酸性環(huán)境下催化蛋白質(zhì)水解的酶。該酶主要用于酒精發(fā)酵、啤酒釀造、毛皮軟化、果酒澄清、醬油釀造、飼料等。

 

測定原理:

酸性條件下,ACP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸;在堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍;鎢藍在680nm有特征吸收峰,通過測定其吸光度增加,來計算ACP活性。

 

自備儀器和樣品:

水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、0.5 mL EP管和蒸餾水。

 

試劑組成和配置:

液體一:2mL×1支,4℃保存。

液體二:1mL×1支,4℃保存。

試劑一的配制:臨用前按液體一:液體二:蒸餾水=90μL):20μL):21mL)的比例配制,現(xiàn)配現(xiàn)用,如出現(xiàn)白色絮狀沉淀則不能用。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解。(可在燒杯上蓋一層保鮮膜,注意觀察,避免水分全部蒸發(fā),一般加熱15-30分鐘,該試劑為過飽和試劑,充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用)。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入20mL蒸餾水溶解。

試劑五:液體4mL×1瓶,4℃保存。

標準品:液體1mL×1支,0.25μmol/mL標準酪氨酸溶液,4℃保存。

 

粗酶液提取:

1、   試劑一的配制:見試劑的組成和配制。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g4離心10min,取上清,即粗酶液。

3、   血清或培養(yǎng)液:直接測定。

4、   細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g4,離心10min,取上清置于冰上待測。

 

測定操作:

1.分光光度計/酶標儀預熱30min,調(diào)節(jié)波長到680 nm,蒸餾水調(diào)零。

 

2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min

3. 對照管:取0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL試劑二,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入40μL試劑三,混勻后8000g4℃離心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,680nm測定光吸收,記為A對照管。

4. 測定管:取0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL試劑三,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入40μL試劑二,混勻后8000g4℃離心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm測定光吸收,記為A測定管。(注意與空白管不同,先加試劑三,后加試劑二)

5. 空白管:取0.5 mL EP管,加入40μL蒸餾水,200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm測定光吸收,記為A空白管。

6. 標準管:取0.5 mL EP管,加入40μL標準品,200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm測定光吸收,記為A標準管。

 

ACP活性計算公式:

1. 按照樣本蛋白濃度計算

ACP活性單位定義:30每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸1個酶活單位

ACP活性(nmol/min /mg prot= C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷Cpr

 

2.按照樣本質(zhì)量計算

ACP活性單位定義:30每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個酶活單位。

ACP活性(nmol/min /g鮮重)=C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V反總÷W×V1÷V2÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷W

 

3. 按照液體體積計算

ACP活性單位定義:30每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

ACP活性(nmol/min/mL=C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V反總÷V1÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)

1.        按照細胞數(shù)量計算

ACP活性單位定義:30104個細胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

ACP活性(nmol/min /104 cell=C標準品×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V反總÷(細胞數(shù)量×V1÷V2÷T= 125×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷細胞數(shù)量

C標準品:0.25 μ mol/mL標準酪氨酸溶液;V反總:酶促反應總體積,0.1mLCpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);V1:加入反應體系中粗酶液體積(mL),0.02 mLV2:提取液總體積(mL),1mLT:催化反應時間(min),10minW:樣品質(zhì)量(g)。

 

注意事項:

1.試劑一按操作指示配制,用多少配多少,出現(xiàn)白色絮狀沉淀則不能用。

2.臨用前配制的試劑配置好后3天內(nèi)使用完畢。

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