谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
GLS(EC 3.5.1.1)是酰胺基水解酶,催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨,在氮素代謝中具有重要調控作用,尤其是調節游離氨含量和尿素代謝。
測定原理:
GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨,利用奈氏試劑檢測氨增加的速率,即可計算其酶活性。
需自備儀器和用品:
臺式離心機、酶標儀、96孔板、可調式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。
試劑組成和配制:
試劑一×2瓶,60 mL,4 ℃保存;
試劑二×1瓶,40 mL,4 ℃保存;
試劑三×1瓶,60 mL,常溫保存;
試劑四×1瓶,5 mL,常溫保存;
試劑五×1瓶,3 mL,常溫保存;
試劑六×1瓶,3 mL,常溫避光保存。
粗酶液提取:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、酶標儀預熱30min以上,調節波長至420nm。
2、樣品測定(在EP管中加入下列試劑):
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 25 | |
蒸餾水 | 25 | |
試劑一 | 100 | 100 |
試劑二 | 400 | 400 |
混勻,37℃水浴1 小時
試劑三 | 525 | 525 |
混勻,8000 g,25℃離心10 min;取上清液,在96孔板中加入下列試劑
上清液 | 130 | 130 |
試劑四 | 30 | 30 |
試劑五 | 20 | 20 |
試劑六 | 20 | 20 |
混勻,室溫靜置15min,420nm處讀取測定管和對照管吸光值,計算ΔA=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。
注意:
1、試劑六如出現沉淀,靜置后取上清使用。
2、ΔA(A測定管-A對照管)若出現負值,可能是酶活性較低,可將反應時間1h延長到2h,相應的在計算公式中除以2。
酶活性計算:
標準條件下測定的回歸方程為y = 1.9244x + 0.0057,R2 = 0.9983;x為標準品濃度(μmol/mL),y為吸光值A。
1、血清(漿)GLS活性
單位定義:每mL血清(漿)每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS(nmol /min /mL)= (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷V樣÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)
2、組織、細菌或細胞GLS活性
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每mg蛋白質每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。
GLS(nmol /min /mg prot)= (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷Cpr。
(2)按樣本鮮重計算:
單位定義:每g組織每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。
GLS(nmol/min /g 鮮重)=(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷W。
(3)按細菌或細胞密度計算
單位定義:每1萬個細菌或細胞每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS(nmol/min/104 cell)=(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T ×1000 =0.7274×(ΔA -0.0057)
V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,60min;V反總:反應體系總體積,1.05mL;V樣:加入反應體系中樣本體積,0.025mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬; 1000,μmol到nmol換算系數。
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