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β-淀粉酶(β-amylase,β-AL)試劑盒說明書

閱讀:384      發(fā)布時間:2023-04-08
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β-淀粉酶(β-amylaseβ-AL試劑盒說明書

                                    微量法100/48

 

    意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

淀粉酶負責水解淀粉,主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可隨機地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵,生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。

 

測定原理:

還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)。α-淀粉酶不耐酸,β-淀粉酶不耐熱。根據(jù)上述特性,鈍化其中之一,就可測出另一種淀粉酶的活力。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

試劑一:30mL×1瓶,常溫保存,若有黃色晶體析出,需90℃加熱溶解后再用;

試劑二:15mL×1瓶,4保存,若出現(xiàn)沉淀析出,需70℃加熱溶解后再用。

 

粗酶液提取:

組織:稱取0.1~0.2g樣本(建議稱取約0.1g樣本),加入1mL蒸餾水,研磨勻漿;將勻漿倒入離心管中,提取液在室溫下放置提取15min,每5min振蕩1次,使其充分提取;3000g25離心10min,取上清液加蒸餾水定容至10 mL,搖勻,即淀粉酶原液。

吸取上述淀粉酶原液1mL,加入4mL蒸餾水,搖勻,即為淀粉酶稀釋液,用于(αβ)淀粉酶總活力的測定。

血清(漿)等液體樣本:1)直接檢測α-淀粉酶。(2)吸取淀粉酶原液1mL,加入4mL蒸餾水,搖勻,即為淀粉酶稀釋液,用于(αβ)淀粉酶總活力的測定。

 

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長到540 nm,蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一和試劑二40℃預(yù)熱10min.

3、測定操作表

試劑名稱(μL

α?淀粉酶活力測定

總淀粉酶活力測定

對照管

測定管

對照管

測定管

淀粉酶原液

75

75



70水浴15min左右冷卻

淀粉酶稀釋液



75

75

蒸餾水

75


75


試劑二


75


75

  40恒溫水浴中準確保溫5min

試劑一

150

150

150

150

混勻,95度水浴5min,冷卻,取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中,540nm處讀取吸光值,從左到右分別記為A1A2A3A4。每個測定管需設(shè)一個對照管。

 

酶活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸曲線為y=3.7215x -0.1778 x為標準品濃度(mg/mL),y為吸光值。

2α?淀粉酶活性

1)按照樣本質(zhì)量計算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(A2-A10.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T

=1.075×(A2-A10.1778)÷W

2)按照蛋白質(zhì)含量計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A10.1778)÷3.7215×V反總V×Cpr÷T

=0.1075×(A2-A10.1778) ÷Cpr

3)血清(漿)等液體樣本中α?淀粉酶活性計算

單位定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(A2-A10.1778)÷3.7215×V反總]÷V÷T=0.1075×(A2-A10.1778)

3、總淀粉酶活性計算

1)按照樣品質(zhì)量計算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min//g鮮重)=[(A4-A30.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T=5.375×(A4-A30.1778)÷W

2)按照蛋白質(zhì)含量計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A30.1778)÷3.7215×V反總V×Cpr÷T

=0.5375×(A4-A30.1778) ÷Cpr

3)血清(漿)等液體樣本中總淀粉酶活性計算

單位定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

淀粉酶活性(mg/min/mL) =5×[(A4-A30.1778)÷3.7215×V反總]÷V÷T

=0.5375×(A4-A30.1778)

4β-淀粉酶活性計算

1)按照樣本質(zhì)量計算

單位定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

β-淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[5.375×(A4-A30.1778)-1.075×(A2-A10.1778)W

2)按照蛋白質(zhì)含量計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

β-淀粉酶活性(mg/min/mg prot=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[0.5375×(A4-A30.1778)-0.1075×(A2-A10.1778)Cpr

3)血清(漿)等液體樣本中β-淀粉酶活性計算

單位定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

 

β-淀粉酶活性(mg/min/mL=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=0.5375×(A4-A30.1778)-0.1075×(A2-A10.1778)

5總淀粉酶稀釋倍數(shù);V反總:反應(yīng)體系總體積,0.15mLV樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075 mLV樣總:提取液總體積,10 mL Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,gT:反應(yīng)時間,5min

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸曲線為y=2.481x -0.1778 x為標準品濃度(mg/mL),y為吸光值。

2α?淀粉酶活性

1)按照樣本質(zhì)量計算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(ΔA0.1778)÷2.481×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T=1.612×(ΔA0.1778)÷W

2)按照蛋白質(zhì)含量計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/mg prot=[(ΔA0.1778)÷2.481×V反總V×Cpr÷T =0.1612×(ΔA0.1778) ÷Cpr

3)血清(漿)等液體樣本中α?淀粉酶活性計算

單位定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/mL=[(ΔA0.1778)÷2.481×V反總]÷V÷T =0.1612×(ΔA0.1778)

 

3、總淀粉酶活性計算

1)按照樣本質(zhì)量計算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(A4-A30.1778)÷2.481×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T

=8.06×(ΔA0.1778)÷W

2)按照蛋白質(zhì)含量計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A30.1778)÷2.481×V反總V×Cpr÷T

=0.806×(A4-A30.1778) ÷Cpr

3)血清(漿)等液體樣本中淀粉酶活性計算

單位定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mL)=5×[(A4-A30.1778)÷2.481×V反總]÷V÷T

=0.806×(A4-A30.1778)

4β-淀粉酶活性計算

1)按照樣本質(zhì)量計算

單位定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

β-淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[8.06×(A4-A30.1778)-1.612×(A2-A10.1778)W

2)按照蛋白質(zhì)含量計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

β-淀粉酶活性(mg/min/mg prot=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[0.806×(A4-A30.1778)-0.1612×(A2-A10.1778)Cpr

3)血清(漿)等液體樣本中β-淀粉酶活性計算

單位定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

 

β-淀粉酶活性(mg/min/mL=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=0.806×(A4-A30.1778)-0.1612×(A2-A10.1778)

5總淀粉酶稀釋倍數(shù);V反總:反應(yīng)體系總體積,0.15mLV樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075 mLV樣總:提取液總體積,10 mL Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,gT:反應(yīng)時間,5min

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