淀粉脫分支酶(Starch debranching enzyme,DBE)試劑盒說(shuō)明書
微量法100管/48樣
注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
DBE能夠?qū)R恍缘亓呀庵ф湹矸鄣摩?/span>-1,6糖苷鍵,產(chǎn)生線性的葡萄糖鏈,在調(diào)整支鏈淀粉分子的鏈長(zhǎng)方面有重要的作用。
測(cè)定原理:
采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定DBE催化支鏈淀粉產(chǎn)生的還原糖,通過(guò)測(cè)定還原糖含量的變化來(lái)計(jì)算DBE活性。
需自備的的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水
試劑的組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體15mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1支,4℃保存;臨用前每支加入6mL試劑一,充分混勻后備用;用不完的試劑4℃保存;
試劑三:液體12mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:液體35mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到540 nm,蒸餾水調(diào)零。
2、加樣表
試劑名稱(μL) | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
95℃水浴5min后滅活的樣本 | 100 | |
粗酶液 | 100 | |
試劑一 | 100 | |
試劑二 | 100 |
混勻,37℃準(zhǔn)確保溫2h
試劑三 | 100 | 100 |
試劑四 | 300 | 300 |
混勻,95℃水浴5min,取200uL至微量石英比色皿或96孔板中,540nm處讀取各管吸光值。ΔA=A測(cè)定
-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)個(gè)一個(gè)對(duì)照管。
注意:可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液,然后集中進(jìn)行5min 95℃沸水浴處理。
DBE活力單位的計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定回歸方程為y = 3.8458x - 0.165;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每h催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T
=0.26× (ΔA+0.165) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(W× V樣÷V樣總)÷T
=0.26× (ΔA+0.165) ÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL; V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定回歸方程為y = 1.9229x - 0.165;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每h催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T
=0.52× (ΔA+0.165) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(W× V樣÷V樣總)÷T
=0.52× (ΔA+0.165) ÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL; V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.1mg/mL-1mg/mL。
ΔA線性范圍為0.01-1。
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