結合態淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase,GBSS)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
GBSS(EC 2.4.1.21)以束縛態存在于淀粉體中,催化淀粉鏈的加長反應,主要負責直鏈淀粉的合成。
測定原理:
GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應,將葡萄糖分子轉移到淀粉引物上,同時生成ADP;進一步通過反應體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH,其中NADPH生成量與前一步反應生成的ADP數量呈正比,通過340nm下測定NADPH的增加量,可以計算GBSS活性。
需自備的的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體100mL×2瓶,4℃保存;
試劑一:40mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入14mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入8mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入10mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
試劑五:液體×1支,-20℃保存;臨用前加入500μL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
試劑六:粉劑×1支,-20℃保存;臨用前加入500μL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
粗酶液制備 :
稱取0.1~0.2g組織(建議稱取約0.1g組織),加入1mL提取液,冰浴中勻漿。10000g ,4℃離心10min,棄上清,在沉淀中加入1mL提取液充分混勻,置冰上待測。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。
2、在EP管中按順序加入下列試劑
試劑名稱(μL) | 測定管 |
樣本 | 75 |
試劑二 | 135 |
混勻,30℃保溫20 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴冷卻
試劑三 | 75 |
混勻,30℃保溫30 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴冷卻,10000g 4℃離心10min,取上清液(如果一次性測定樣本較多,可以將試劑四、五和六按比例配成混合液)
上清液 | 150 |
試劑四 | 100 |
試劑五 | 5 |
試劑六 | 5 |
混勻后立即340 nm波長下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1。
注意:試劑二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混勻。
GBSS活性計算:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
1、按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GBSS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數
=529×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
2、按照樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GBSS活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T×稀釋倍數=529×ΔA÷W
V 反總:反應體系總體積,2.6×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.075 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;稀釋倍數:1.9;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量。
b.使用96孔板測定的計算公式如下:
1、按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GBSS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數
=1059×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
2、按照樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GBSS活性(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T×稀釋倍數 =1059×ΔA÷W
V 反總:反應體系總體積,2.6×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.075 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;稀釋倍數:1.9;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量。
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