天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase，AS) 活性測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
天冬酰胺合成酶是廣泛存在于生物體內的一類氨基轉移酶，催化谷氨酞胺的氨基向天冬氨酸轉移。當植物處于氨毒時天冬酞胺的形成是一種解毒反應。
測定原理：
AS催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計算其酶活性。
需自備儀器和用品：
臺式離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。
試劑組成和配制：
試劑一×2瓶，60 mL，4 ℃保存；
試劑二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；
試劑三×1瓶，60 mL，常溫保存；
試劑四×1瓶，5 mL，常溫保存；
試劑五×1瓶，3 mL，常溫保存；
試劑六×1瓶，3 mL，常溫避光保存。
粗酶液提?。?/span>
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至420nm，蒸餾水調零。
2、樣品測定（在EP管中加入下列試劑）：
試劑名稱（uL） | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 25 | |
蒸餾水 | 25 | |
試劑一 | 100 | 100 |
試劑二 | 400 | 400 |
混勻，37℃水浴1 小時
試劑三 | 525 | 525 |
混勻，8000 g，25℃離心10 min；取上清液，在EP管或96孔板中加入下列試劑
上清液 | 130 | 130 |
試劑四 | 30 | 30 |
試劑五 | 20 | 20 |
試劑六 | 20 | 20 |
混勻，室溫靜置15min，420nm處讀取測定管和對照管吸光值，計算ΔA=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。
注意：試劑六如出現沉淀，靜置后取上清使用。
酶活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.662x -0.0434；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值A。
1、血清（漿）AS活性
單位定義：每mL血清（漿）每小時產生1μg 氨定義為一個酶活力單位。
AS（μg/h/mL）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷V樣÷T=31.722×(ΔA+0.0434)
2、組織、細菌或細胞中AS活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每小時產生1μg 氨定義為一個酶活力單位。
AS活力（μg/h/mg prot）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =31.722×(ΔA+0.0434) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每小時產生1μg氨定義為一個酶活力單位。
AS活力（μg/h/g 鮮重）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =31.722×(ΔA +0.0434) ÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每小時產生1μg 氨定義為一個酶活力單位。
AS活力（μg/h/104 cell）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.0634×(ΔA+0.0434)
T：反應時間，1h； V反總：反應體系總體積：0.525mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.025mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量， g；500：細菌或細胞總數，500萬
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.3046x -0.0097；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值A。
1、血清（漿）AS活力的計算:
單位的定義：每mL血清（漿）每小時產生1μg 氨定義為一個酶活力單位。
AS活力（μg/h/mL）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反總÷V樣÷T=68.94×(ΔA +0.0097)
2、組織、細菌或細胞中AS活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每小時產生1μg 氨定義為一個酶活力單位。
AS活力（μg/h/mg prot）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =68.94×(ΔA +0.0097) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每小時產生1μg氨定義為一個酶活力單位。
AS活力（μg/h/g 鮮重）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =68.94×(ΔA +0.0097）÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每小時產生1μg 氨定義為一個酶活力單位。
AS活力（μg/h/104 cell）＝(ΔA+0.0097) ÷0.3046×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.1379×(ΔA +0.0097)
T：反應時間，1h； V反總：反應體系總體積：0.525mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.025mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量， g；500：細菌或細胞總數，500萬。
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