硝酸還原酶(Nitrate Reductase,NR)活性測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
NR( EC 1.7.1.3)廣泛存在于植物中,是植物硝態氮轉化為氨態氮的關鍵酶,也是誘導酶,對作物的產量和品質有影響。
測定原理:
NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,NO3ˉ +NADH+H+→ NO2ˉ +NAD+ +H 2 O;產生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下,與對–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物;生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰,可用分光光度法測定。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
誘導劑儲備液:液體50mL×1瓶,4℃保存。
提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體10mL×1瓶,-20℃保存。
試劑二:液體5mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體6mL×1瓶,4℃保存(如出現結晶析出,60℃-90℃水浴溶解后使用);
試劑四:液體6mL×1瓶,4℃保存。
試劑五:標準儲備液1mL,-20℃保存。
誘導劑應用液的配制:用時將誘導劑儲備液稀釋10倍,即取10mL誘導劑儲備液加90mL蒸餾水,充分混勻。
0.1umol/mL的標準液的配制:用時將試劑五稀釋100倍,即取 0.1ml試劑五加9.9mL蒸餾水,充分混勻。
樣本前處理:
動植物組織樣品的前處理:
(1)取適量誘導劑于燒杯中,將新鮮標本洗凈,濾紙吸干,放入誘導劑應用液中(淹沒即可),浸泡2h,取出樣本,濾紙吸干。
(2)按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
注意:
1、 建議使用新鮮沒有冷凍過的樣本。
2、 一般不要誘導處理,預測定結果沒有活性(A測定≤A對照管)則需要誘導處理。
細菌或培養細胞的前處理:
先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至540nm,蒸餾水調零。
2、樣本測定(在EP管或96孔板中加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 加樣孔 | |||
測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 | |
樣本 | 20 | 20 | ||
0.1μmol/mL標準液 | 20 | |||
蒸餾水 | 75 | 95 | ||
試劑一 | 75 | 75 | ||
試劑二 | 25 | 25 | 25 | 25 |
混勻后,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)反應30min
試劑三 | 50 | 50 | 50 | 50 |
試劑四 | 50 | 50 | 50 | 50 |
混勻,25℃室溫顯色20min,540nm處比色
注意:1、標準管和空白管只需測一次,每個測定管設一個對照管。
2、誘導處理后的樣本對照管中試劑二改成加25μL蒸餾水。
NR活性計算:
(1)按樣本鮮重計算:
單位定義:每小時每g鮮重樣品中催化產生 1μmol NO2ˉ的量為一個 NR活力單位。
NR(μmol/h/g 鮮重)= (C標準管×V1)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每小時每mg組織蛋白催化產生 1μmol NO2ˉ的量為一個 NR活力單位。
NR(μmol/h/mg prot)=(C標準管×V1)×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=0.2×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr
C標準管:標準管濃度,0.1μmol/mL;V1:加入樣本體積:0.02mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,0.5h;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。
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