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亞硝酸還原酶(Nitrite reductase,NiR)試劑盒說(shuō)明書

閱讀:345      發(fā)布時(shí)間:2023-04-09
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亞硝酸還原酶(Nitrite reductaseNiR)試劑盒說(shuō)明書

 微量法100T/48S

   意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

硝酸還原酶(NiR)是一類能催化亞硝酸鹽還原的,廣泛存在于微生物及植物體內(nèi),是自然界氮循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶,可以將亞硝酸鹽降解為NONH3,從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累,降低因亞硝酸鹽累積而造成的對(duì)生物體的毒害作用。

測(cè)定原理

亞硝酸還原酶可將NO2還原為NO,使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2減少,即540nm處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品天平、研缽、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機(jī)。

試劑的組成和配制

提取液:液體112mL×1瓶,4保存。

試劑一:液體4mL×1瓶,4保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加5mL蒸餾水溶解。

試劑三:液體5mL×1瓶,4保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)

試劑四:液體10mL×1瓶,4避光保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)  

試劑五:液體10mL×1瓶,4避光保存。

工作液:臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。

酶液提取

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2.細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后10000g4℃離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作表


空白管

對(duì)照管

測(cè)定管

樣本(μL


20

20

蒸餾水(μL

20

40


試劑一(μL

40


40

試劑二(μL

40

40

40

混勻后,25℃反應(yīng)1h

試劑三(μL

40

40

40

充分震蕩30S

上清液(μL

70

70

70

工作液(μL

140

140

140

充分混勻,,靜置3min后測(cè)定各管540nm吸光值,分別記為A空白管、A對(duì)照管、A測(cè)定管。空白管只要做一管,每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

計(jì)算公式

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.3594x + 0.0072R2 = 0.9997x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)。

1.按照蛋白含量計(jì)算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)活力單位。

NiRμmol/h /mg prot= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷V×Cpr÷T = 1.47×A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義:每克組織每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)活力單位。

NiRμmol/h/g 鮮重=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷W ×V÷V樣總÷T = 1.47×A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義:每104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)活力單位。

NiRμmol/h /104 cell= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T = 1.47×A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072÷細(xì)胞數(shù)量

V標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.04mLV樣:體系中加入樣本體積,0.02mLV樣總:加入提取液體積,1mLT:反應(yīng)時(shí)間,1h Cpr:樣本蛋白含量;W:樣本質(zhì)量,g

b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.6797x + 0.0072R2 = 0.9997x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)。

1.按照蛋白含量計(jì)算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)活力單位。

NiRμmol/h /mg prot= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V標(biāo)÷V×Cpr÷T = 2.94×A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義:每克組織每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)活力單位。

NiRμmol/h/g 鮮重=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V標(biāo)÷W ×V÷V樣總÷T = 2.94×A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義:每104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)活力單位。

NiRμmol/h /104 cell= [A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V標(biāo)÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T = 2.94×A空白管-A測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072÷ 細(xì)胞數(shù)量

V標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.04mLV樣:體系中加入樣本體積,0.02mLV樣總:加入提取液體積,1mLT:反應(yīng)時(shí)間,1h Cpr:樣本蛋白含量;W:樣本質(zhì)量,g

注意事項(xiàng)

1.        配制好的工作液3天內(nèi)使用完。

2.        若吸光值超過(guò)1.5,將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3.        嚴(yán)格控制顯色時(shí)間,否則會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。

4.        標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL

5.        A空白管-A測(cè)定管-A對(duì)照管)線性范圍為0.02-1.5


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