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可溶性淀粉合成酶(SSS)試劑盒說明書

閱讀:316      發布時間:2023-04-10
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可溶性淀粉合成酶(Soluble starch synthaseSSS試劑盒說明書

                                      微量法100/96

   意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

SSSEC 2.4.1.21通常以游離態存在于質體基質中,催化淀粉鏈延長,主要負責支鏈淀粉的合成。

測定原理

SSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應,將葡萄糖分子轉移到淀粉引物上,同時生成ADP,在反應體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPHNADPH生成量與前一步反應中ADP生成量呈正比,340nm下測定NADPH增加量即可計算SSS活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:40mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入14mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

試劑三:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入8mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

試劑四:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入10mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

試劑五:液體×1支,-20保存;臨用前加入500μL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

試劑六:粉劑×1支,-20保存;臨用前加入500μL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

粗酶液制備

按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2、在EP管中按順序加入下列試劑

試劑名稱μL

測定管

樣本

75

試劑二

135

混勻,30保溫20 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴冷卻

試劑三

75

混勻,30保溫30 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴冷卻,10000g 4離心10min,取上清液(如果一次性測定樣本較多,可以將試劑四、五和六按比例配成混合液)

上清液

150

試劑四

100

試劑五

5

試劑六

5

混勻后立即340 nm波長下記錄初始吸光度A1 2min后的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1

注意:試劑二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混勻。

SSS活性計算

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1、按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

SSSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T×稀釋倍數

               =529×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

SSS活性(nmol/min /g 鮮重=[ΔA×V反總÷ε×d×109V÷V樣總×W÷T×稀釋倍數

                   =529×ΔA÷W

V 反總:反應體系總體積,2.6×10-4 LεNADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.075 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,2 min;稀釋倍數:1.9Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量。

b.使用96孔板測定的計算公式如下:

1、按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

SSSnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T×稀釋倍數

=1059×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

SSS活性(nmol/min/g 鮮重=[ΔA×V反總÷ε×d×109V÷V樣總×W÷T×稀釋倍數 =1059×ΔA÷W

V 反總:反應體系總體積,2.6×10-4 LεNADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.075 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,2 min;稀釋倍數:1.9Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量。


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