腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGP)活性測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。
測定原理:
AGP催化的逆向反應(yīng)生成G1P,在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下測定NADPH增加速率,即可計算AGP活性。
需自備的的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入9mL蒸餾水充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
粗酶液制備 :
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、試劑一置30℃保溫10min以上。
3、在EP管中按順序加入下列試劑
試劑名稱(μL) | 測定管 |
試劑一 | 50 |
試劑二 | 80 |
樣本 | 10 |
混勻,30℃保溫15 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴迅速冷卻后,4000g4℃離心5min,
取上清液,在96孔板中依次加入下列試劑
上清液 | 80 |
試劑一 | 85 |
試劑三 | 35 |
混勻后,立即于340 nm波長下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1。
AGP活性計算:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
1、按樣本蛋白蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活性單位。
AGP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)
=2813×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
AGP(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T×稀釋倍數(shù)
=2813×ΔA÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;稀釋倍數(shù):1.75;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量。
b.使用96孔板測定的計算公式如下:
1、按樣本蛋白蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活性單位。
AGP(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)
=5627×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
AGP(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T×稀釋倍數(shù)
=5627×ΔA÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;稀釋倍數(shù):1.75;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量。
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