NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-MDH)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
MDH (EC 1.1.1.37)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,線粒體中MDH是TCA循環的關鍵酶之一,催化蘋果酸形成草酰乙酸;相反,胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產物, 連接多條重要的代謝途徑。因此,MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色,包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統、活性氧代謝和抗病性等。根據不同的輔酶特異性,MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH, NADP-MDH主要存在于真核細胞中。
測定原理:
NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸,導致340nm處光吸收下降。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一、提取液100 mL×1瓶,在4℃保存;
試劑二、液體20 mL×1瓶,在4℃保存;
試劑三、粉劑×1瓶,-20℃保存;
樣本測定的準備:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。
2、檢測工作液的配制:用時在試劑三中加入19mL試劑二和0.5mL蒸餾水,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
3、測定前將檢測工作液在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液,混勻后立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。
注意:若A1-A2大于0.5,需將酶液用提取液稀釋,使A1-A2小于0.5,可提高檢測靈敏度。計算公式中乘
以相應稀釋倍數。
NADP-MDH活力單位的計算:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)NADP-MDH活力的計算
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=6430×ΔA
2、組織、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T =6430×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×500)÷T=12.86×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.005 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;W:樣本質量,g;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;500:細胞或細菌總數,500萬。
b. 用96孔板測定的計算公式如下
1、血清(漿)NADP-MDH活力的計算
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=12860×ΔA
2、組織、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T =12860×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=25.72×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.005 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;W:樣本質量,g;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;500:細胞或細菌總數,500萬。
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