NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
NOX(EC 1.6.99.3)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,可在氧氣存在下,直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生,而且與免疫反應密切相關。
測定原理:
NOX能夠將NADH氧化為NAD,NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍(DCPIP)的還原相偶聯,藍色的DCPIP被還原為無色的DCPIP,在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水
試劑的組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:液體20mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體1.5mL×1瓶,-20℃保存;
試劑四:液體25mL×1瓶,4℃保存。
試劑五:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入5mL蒸餾水,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g,4℃離心5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4℃離心10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的NOX(此步可選做)。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于NOX活性測定。
血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至600nm,蒸餾水調零。
2、 樣本測定
(1)試劑四于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL試劑四和40μL試劑五,混勻,記錄600nm處20s時吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。
NOX活力單位的計算:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)NOX活力的計算:
單位的定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。
NOX(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA
2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。
NOX(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。
NOX(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。
NOX(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V反總:反應體系總體積,0.25mL; V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量;500:細胞或細菌總數,500萬。
b. 使用96孔板測定的計算公式如下:
1、血清(漿)NOX活力的計算:
單位的定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。
NOX(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=5000×ΔA
2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。
NOX(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。
NOX(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。
NOX(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T=2.02×ΔA
V反總:反應體系總體積,0.25mL; V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量;500:細胞或細菌總數,500萬。
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