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單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性測定試劑盒說明書

閱讀:381      發(fā)布時間:2023-04-26
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單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性測定試劑盒說明書

 

微量法100T/96S

 

 

注 意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

 

 

測定意義:

 

MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA,在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

 

 

測定原理:

 

MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA NAD+NADH 340 nm 有特征吸收峰,但是 NAD+沒有。通過測定 340 nm 光吸收下降速率,來計算出 MDHAR 活性。

實驗中所需儀器及設備:

 

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調式移液槍和雙蒸水

 

 

試劑組成和配置:

 

試劑一:液體 100mL×1 瓶,4保存。

 

試劑二:液體 20mL×1 瓶,室溫保存。

 

試劑三:粉劑×1 瓶(棕色),4保存。臨用前加入 3 mL 蒸餾水充分溶解。

 

試劑四:粉劑×1 瓶,4保存。臨用前加入 2.5 mL 蒸餾水充分溶解。

 

試劑五:液體 15μL×1 瓶,4保存。臨用前加 3 mL 試劑二充分溶解。

 

 

粗酶液提取:

 

1.        組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿。8000g4離心 10min,取上清置冰上待測。

 

2. . 細菌、真菌:按照細胞數量(104 個):試劑一體積(mL)為 500~10001 的比例(建

 

500 萬細胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);8000g 4離心 20min,取上清液置冰上混勻待測。

 

3.        血清等液體:直接測定。

 

 

MDHAR 測定操作:

 

1.    分光光度計/酶標儀預熱 30 min,調節(jié)波長到 340 nm,蒸餾水調零。

 

2.    試劑二在 25水浴鍋中預熱 30 min

 

3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 試劑三、20μL 試劑四、20μL 試劑五和 120μL 試劑二,最后加入 20μL 上清液,迅速混勻后于 340nm 比色,記錄 30s 150s 的吸光值 30s

 

150s 的吸光值 A1 A2A=A1-A2

 

 

MDHAR 活性計算公式:

 

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

 

(1). 按蛋白濃度計算

 

MDHAR 活性單位定義:25中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = A÷ε÷d×V 反總×109Cpr×V 樣)÷T

 

= 804×A ÷Cpr

 

(2). 按樣本質量計算

 

MDHAR 活性單位定義:25中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 1U MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = A÷ε÷d×V 反總×109W×V ÷V 樣總)÷T

 

= 804×A ÷W

 

3)按細胞數量計算

 

 

MDHAR 活性單位定義:25中每 104 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADH  1 個酶活單位。

 

MDHAR (nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V 反總×109÷(細胞數量×V ÷V 樣總)÷T = 804×A ÷ 細胞數量

 

4)按液體體積計算

 

MDHAR 活性單位定義:25中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣)÷T

 

= 804×A

 

εNADH 摩爾消光系數,6220 L/mol/cmd:比色皿光徑,1cmV 反總:反應體系總體積,0.2mL=2×10-4LV 樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02mLV 樣總:提取液體積,

1  mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質濃度需要另外測定,建議使用本公司蛋白質含量 BCA 試劑盒;W :樣品質量;T:反應時間,2min

 

b.使用 96 孔板測定的計算公式如下:

 

(1). 按蛋白濃度計算

 

MDHAR 活性單位定義:25中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = A÷ε÷d×V 反總×109Cpr×V 樣)÷T

 

= 1608×A ÷Cpr

 

(2). 按樣本質量計算

 

MDHAR 活性單位定義:25中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 1U MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = A÷ε÷d×V 反總×109W×V ÷V 樣總)÷T

 

= 1608×A ÷W

 

3)按細胞數量計算

 

MDHAR 活性單位定義:25中每 104 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADH 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V 反總×109÷(細胞數量×V ÷V 樣總)÷T

= 1608×A ÷  細胞數量

 

4)按液體體積計算

 

MDHAR 活性單位定義:25中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min /mL) = A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣)÷T

 

=1608×A

 

εNADH 摩爾消光系數,6220 L/mol/cmd96 孔板光徑,0.5cmV 反總:反應體系總體積,0.2mL=2×10-4LV 樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02mLV 樣總:提取液體積,1 mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質濃度需要另外測定,建議使用本公司蛋白質含量 BCA 試劑盒;W :樣品質量;T:反應時間,2min

 

注意事項:

 

臨用前配制的試劑未使用完的 4保存,3 天內使用完。

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優(yōu)利科(上海)生命科學有限公司

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