甲醛脫氫酶(Formaldehyde Dehydrogenase,FDH)試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
甲醛是一種能與蛋白質、核酸和脂類產生非特異性反應的活潑化合物,對所有生物都具有很高毒性。甲醛脫氫酶作為含鋅中等鏈醇脫氫酶(ADH)的家庭成員之一,廣泛存在于原核和真核生物中,該酶能利用NAD+作為輔酶,將有毒的甲醛氧化,是甲醛氧化途徑中的關鍵酶。
測定原理:
甲醛脫氫酶催化甲醛和NAD+產生NADH,在340nm處的吸光值會增加,測定340nm處的吸光值變化,可計算得到甲醛脫氫酶的活性。
自備實驗用品及儀器:
天平、離心機、酶標儀、96孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體15mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入6mL水溶解待用,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
試劑三:粉劑×1支,4℃保存;臨用前加入1.5mL水溶解待用。
試劑四:液體1.5mL×1支,4℃避光保存。
FDH提取:
1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃,離心20min。
2. 細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 液體:直接檢測。
測定操作表:
1、 酶標儀預熱30min,調節波長至340nm。
2、 操作表
在96孔板中加入如下試劑
測定管 | |
樣本(µL) | 20 |
試劑一(µL) | 110 |
試劑二(µL) | 50 |
試劑三(µL) | 10 |
試劑四(µL) | 10 |
混勻,于340nm下測定初始吸光值A1與5min后的吸光值A2,△A=A2-A1。
若樣本數量較多,可將試劑按比例配成工作液使用。
FDH酶活計算:
(1)按蛋白濃度計算
酶活定義:每毫克蛋白每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。
FDH酶活(nmol/min/mg prot)= ×V反總÷(V樣×Cpr)÷T = 643×△A÷Cpr
(2)按樣本質量計算
酶活定義:每克樣品每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。
FDH酶活(nmol/min/g 鮮重)= ×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T =643×△A÷W
(3)按照細胞數量計算
酶活定義:每104個細胞每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。
FDH酶活(nmol/min/104cell)= ×V反總÷(V樣÷V樣總×細胞數量(萬個))÷T= 643×△A÷細胞數量
(4)按液體體積計算
酶活定義:每mL樣本每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。
FDH酶活(nmol/min/mL)= ×V反總÷V樣÷T=643×△A
:NADH微摩爾消光系數,6.22×10-3 L/µmol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V反總:反應體系總體積,0.2mL;V樣:反應體系中樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T,反應時間,5min;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g
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