檸檬酸合酶(citrate synthase,CS)試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
CS(EC 2.3.3.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體基質(zhì)中,是三羧酸循環(huán)第一個限速酶,是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點之一。
測定原理:
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A,進一步水解產(chǎn)生檸檬酸;該反應促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,在 412nm處有特征吸光值。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:液體20mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體1.5mL×1支,-20℃保存;
試劑四:液體28mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存;
試劑六:粉劑×1支,-20℃保存,臨用前加入1.2mL蒸餾水,用不完的試劑仍-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g,4℃離心5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
④ 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的CS(此步可選做)。
⑤ 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體CS測定。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至412nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
(1)在試劑五中加入0.6mL無水乙醇和13mL試劑四,混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
(2)測定管:在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、220μL試劑五和10μL試劑六,混勻,37℃反應15min后立即測定吸光值A1。
(3)對照管:在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、220μL試劑四和10μL試劑六,混勻,37℃
反應15min后立即測定吸光值A2。
(4)計算ΔA=A1-A2,每個測定管設一個對照管。
CS活性計算:
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=23.8×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.0475×ΔA
V反總:反應體系總體積,2.4×10-4 L;ε:TNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,15 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500萬。
b. 使用96孔板測定的計算公式如下:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=47.5×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.095×ΔA
V反總:反應體系總體積,2.4×10-4 L;ε:TNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,15 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500萬。
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