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乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)試劑盒說明書

閱讀:374      發布時間:2023-04-26
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乳酸脫氫酶(Lactate DehydrogenaseLDH)試劑盒說明書

微量法100/48

 

    正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

LDHEC 1.1.1.27)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,是糖酵解途徑的末端酶,催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應,伴隨著NAD+/NADH之間互變。

 

測定原理:

LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸進一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中顯棕紅色,顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:60mL×1瓶, 4保存;

試劑一:液體5 mL×1瓶, 4保存;

試劑二:粉劑×1支,-20保存,用時加入10μL試劑五和1.3 mL蒸餾水充分溶解備用,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

試劑三:液體5 mL×1瓶,4保存;

試劑四:液體20 mL×1瓶,4保存;

試劑五:液體100μL×1支,4保存;

 

樣品測定的準備:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為1000~50001的比例(建議2000萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至450nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定(在EP管中加入下列試劑)

試劑名稱(μL)

測定管

對照管

樣本

10

10

試劑一

50

50

試劑二

10


蒸餾水


10

充分混勻,37(哺乳動物)或25(其它物種)準確水浴15min

試劑三

50

50

充分混勻,37(哺乳動物)或25(其它物種)準確水浴15min

試劑四

150

150

充分混勻,室溫靜置15min 450 nm下測定吸光度,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需要設一個對照管。

 

LDH活力單位的計算:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸曲線, y = 0.9108x+0.0037   (x為標準品濃度,umol/mLy為ΔA)

2、血清(漿)LDH活力的計算

單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDHnmol/min/mL=ΔA-0.0037÷0.9108÷T×103=73.2×ΔA

3、細胞、細菌和組織中LDH活力的計算

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDHnmol/min/mg prot=[ΔA-0.0037÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =73.2×ΔA÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。

2 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDHnmol/min/g鮮重=[ΔA-0.0037÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =73.2×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDHnmol/min/104 cell= [ΔA-0.0037÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.037×ΔA

V1:加入反應體系中樣本體積,0.01mLV2:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,15 minCpr:蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g2000:細胞或細菌總數,2000萬;1031umol/mL=103 nmol/mL

 

b. 使用96孔板測定的計算公式如下:

1、標準條件下測定的回歸曲線, y = 0.4554x+0.0037   (x為標準品濃度,umol/mLy為ΔA)

2、血清(漿)LDH活力的計算

單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDHnmol/min/mL=ΔA-0.0037÷0.4554÷T×103=146.4×ΔA-0.0037

3、細胞、細菌和組織中LDH活力的計算

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDHnmol/min/mg prot=[ΔA-0.0037÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =146.4×ΔA-0.0037÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。

2 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDHnmol/min/g鮮重=[ΔA-0.0037÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =146.4×ΔA-0.0037÷W

 

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDHnmol/min/104 cell= [ΔA-0.0037÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.073×ΔA-0.0037

V1:加入反應體系中樣本體積,0.01mLV2:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,15 minCpr:蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g2000:細胞或細菌總數,2000萬;1031umol/mL=103 nmol/mL

1、   標準曲線線性范圍為:0.1 umol/mL -2 umol/mL

2、   ΔA線性范圍為:0.01 -1

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優利科(上海)生命科學有限公司

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