乙醇含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100管/96樣
注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
酒是含酒精(乙醇)飲料的統(tǒng)稱,乙醇是酒的主要成分,是衡量酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。我國(guó)是世界上Z早發(fā)明釀酒的國(guó)家,也是酒類產(chǎn)品消費(fèi)大國(guó),其消費(fèi)量居世界zhi首。因此,快速、準(zhǔn)確測(cè)定酒中乙醇含量,對(duì)于確保酒的質(zhì)量和保護(hù)消費(fèi)者的健康具有重大意義。
測(cè)定原理:
乙醇在乙醇脫氫酶的催化下氧化脫氫生成乙醛,同時(shí),NAD 被還原生成 NADH,NADH 在 1-mPMS 的作用下使 WST-8 顯橙黃色,通過(guò) 450 nm 下測(cè)定吸光值變化可測(cè)得乙醇含量。
需自備的儀器和用品:
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰、蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體 12 mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1 瓶, -20℃保存;臨用前加入 6 mL 試劑三充分溶解待用,用不完的試劑分裝后-20℃保存;
試劑三:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存;
試劑四:液體 1.5mL×1 管, 4℃避光保存。
乙醇提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):蒸餾水體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 蒸餾水),進(jìn)行勻漿,8000g,25℃離心 10min,取上清待測(cè)。
2. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):蒸餾水體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 蒸餾水),超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次), 8000g,25℃離心 10min,取上清待測(cè)。
3. 血清(漿)等液體樣品:直接測(cè)定。
測(cè)定步驟:
1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm。
2. 工作液的配制:臨用前按照樣本數(shù)量,按以下比例配制工作液
試劑名稱 體積(μL)
試劑一 100
試劑二 50
試劑四 10
3. 樣本測(cè)定
按下表在 96 孔板中加入如下試劑
試劑名稱 體積(μL)
樣本 40
測(cè)定工作液 160
混勻后記錄 450nm 下測(cè)定初始吸光值 A1,和 37℃避光孵育 10min 后的吸光值 A2,計(jì)算△A=A2-A1。
乙醇含量計(jì)算:
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0256x + 0.0055 | R2 = 0.9991; |
x 為乙醇含量(μmol/mL),y 為吸光值差值△A。
1. 按照血清(漿)體積計(jì)算
乙醇含量(μmol/mL)= (△A-0.0055)÷0.0256
=39.1×(△A-0.0055)
2. 按照樣品質(zhì)量計(jì)算
乙醇含量(μmol/g 鮮重)= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷(W ×V1÷V2)
= 39.1×(△A-0.0055)÷W
3. 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
乙醇含量(μmol/104 cell)= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷(500×V1÷V2)
=0.078×(△A-0.0055)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.04mL;V2:加入提取液體積,1 mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn);
注意事項(xiàng):
測(cè)定前取 1-2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),若△A﹥0.3 或乙醇含量﹥10μmol/mL,需將樣本用蒸餾水稀釋后再測(cè)定,以確保測(cè)定的準(zhǔn)確性。
Z低檢測(cè)限:0.02μmol/mL。
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