酰基轉移酶(alcohol acyl transferase,AAT)活性測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
AAT是一個多功能蛋白大家族,主要負責催化生物體內各種酰基化和去酰基化反應,在基因表達、代謝和信號傳導中具有重要作用。
測定原理:
AAT催化乙酰CoA轉移乙酰基到丁醇,釋放的CoA還原DTNB生成TNB;TNB在412nm有吸收峰,測定412 nm吸光度增加速率可計算AAT活性。
自備儀器和用品:
研缽、冰、臺式離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存。
試劑三:粉劑×1支,4℃避光保存。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 液體:直接檢測。
AAT測定操作:
1、分光光度計/酶標儀預熱30min,調節(jié)波長到412 nm,蒸餾水調零。
2、工作液的配制:臨用前在試劑二瓶中加入18mL試劑一,充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
3、試劑三的配制:臨用前加無水乙醇1mL充分溶解待用,用不完的試劑4℃保存。
4、 空白管:在Ep管或96孔板中加入10μL提取液和180μL工作液,充分混勻,35℃反應15min,加入10μL試劑三,充分混勻,25℃靜置10min,測定412nm處吸光值,記為A空白管。
5、 測定管:在Ep管或96孔板中加入10μL樣本和180μL工作液,充分混勻,35℃反應15min,加入10μL試劑三,充分混勻,25℃靜置10min,測定412nm處吸光值,記為A測定管。△A=A測定管- A空白管,空白管只要做一管。
AAT活性計算:
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1)按照蛋白濃度計算
活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷(×d)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T = 98.04×△A÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
活性單位定義:每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷(×d)×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T = 98.04×△A÷W
(3)按細胞數(shù)量計算
活性單位定義:每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷(×d)×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T= 98.04×△A÷ 細胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷(×d)×V反總÷V樣÷T = 98.04×△A
:TNB消光系數(shù),13600L/mol/cm;d:比色皿光徑:1cm;V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:加入反應體系中上清液體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白含量,mg/mL;W:樣本質量,g;T:反應時間,15 min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1)按照蛋白濃度計算
活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷(×d)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =196.08×△A÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
活性單位定義:每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷(×d)×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T = 196.08×△A÷W
(3)按細胞數(shù)量計算
活性單位定義:每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷(×d)×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T=196.08×△A÷ 細胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷(×d)×V反總÷V樣÷T = 196.08×△A
:TNB消光系數(shù),13600L/mol/cm;d:96孔板光徑:0.5cm;V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:加入反應體系中上清液體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白含量,mg/mL;W:樣本質量,g;T:反應時間,15min。
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