ATP-檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
ACL(EC4.1.3.8)是脂肪酸合成中的關鍵酶,其催化產生的乙酰輔酶A可用于脂肪酸合成和碳鏈延長、黃酮類物質合成、氨基酸合成等。
測定原理:
ACL在ATP和輔酶A存在的情況下催化檸檬酸裂解為乙酰輔酶A、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸鹽。蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+,在340nm測定NADH減少速率,計算ACL活性。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體2μL×1支,4℃保存;
樣本的前處理:
1、細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至340nm,蒸餾水調零。
2、 樣本測定
(1)工作液的配置,將試劑二和試劑三轉移至試劑一中,充分混合溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;(注意:可取少量試劑一至試劑二和試劑三中,充分混勻溶解后轉移至試劑一瓶中,重復2-3遍);用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液,混勻,立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。
ACL活性計算:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)ACL活力計算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=1608×ΔA
2、組織、細菌或細胞中ACL活力計算
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位定義:每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
b. 用96孔板測定的計算公式如下
1、血清(漿)ACL活力計算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=3216×ΔA
2、組織、細菌或細胞中ACL活力計算
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位定義:每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.432×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
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