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脂氧合酶(LOX)活性測定試劑盒說明書

閱讀:298      發(fā)布時間:2023-05-10
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脂氧合酶(LOX活性測定試劑盒說明書

                                         微量法100T/48S


    意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

LOX廣泛存在于動植物組織中,催化不飽和脂肪酸氧化反應(yīng),導(dǎo)致膜脂過氧化。在生物體的生長發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過程中具有重要作用。

 

測定原理:

LOX催化亞油酸氧化,氧化產(chǎn)物在280nm處有特征吸收峰;測定280nm吸光度增加速率,來計(jì)算LOX活性。

 

自備儀器和用品:

研缽、冰、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4保存。

試劑二:液體20mL×1瓶,4保存。

試劑三:粉劑×1支,4保存。

 

粗酶液提取:

按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。16000g4離心20min,取上清置冰上待測。

 

測定:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長到280 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 在試劑三中加入10mL試劑二(振蕩混勻1min),在30水浴中預(yù)熱10 min以上。用不完的試劑4℃保存。

3. 對照管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL樣本和180μL試劑二,30℃反應(yīng)30min后,記錄A對照。

4. 測定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL樣本和180μL試劑三,30℃反應(yīng)30min后,記錄A測定。

5. ΔA=A測定-A對照

 

LOX活性計(jì)算:

1)按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.01個單位為1個酶活單位。

LOX (U/mg prot) =ΔA×V反總÷(Cpr×V)÷T×100

= 33.33×ΔA÷Cpr

 

2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.01個單位為1個酶活單位

LOX (U/g 鮮重) =ΔA×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T×100

= 33.33×ΔA÷W

Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,需另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=0.2mL;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02mL;W :樣品質(zhì)量,g;V樣總:上清液總體積,1mL;T:反應(yīng)時間,30min。

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優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司

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