丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
PDC主要存在于酵母中,是乙醇發酵的關鍵酶之一,催化丙酮酸脫羧生成乙醛。
測定原理:
PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛,添加乙醇脫氫酶(ADH)來進一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+;NADH在340 nm有吸收峰,而NAD+沒有;通過測定340 nm光吸收下降速率,來計算PDC活性。
自備儀器和用品:
研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體18mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體2.5mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:粉劑×1支,﹣20℃保存。
試劑五:液體30μL×1瓶,﹣20℃保存。
混合試劑:臨用前配制,將試劑四和試劑五轉移至試劑三中充分溶解待用,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
試劑六:液體2mL×1管,4℃保存。
粗酶液提取:
1、細菌或細胞處理:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照每200萬細菌或細胞加入400μL提取液,超聲波破碎細菌或細胞(功率200W,工作3s,間歇10s,工作35次),16000g 4℃離心20min,取上清,置冰上待測。
2、組織處理:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿,16000g 4℃離心20min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
PDC測定操作:
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到340 nm,蒸餾水調零。
2. 試劑二置于25℃水浴中預熱30min。
3. 空白管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六,迅速混勻后于340nm比色,記錄15s和75s的吸光值,分別記為A1和A2。
4. 測定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六,迅速混勻后于340nm比色,記錄15s和75s的吸光值,分別記為A3和A4。
注意:空白管只需測定一次。
PDC活性計算:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1)按照蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。
PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(Cpr×V樣) ÷T
=1608×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
活性單位定義:25℃中,每克組織每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。
PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(W×V樣÷V樣總) ÷T
=1608×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷W
(3)按細胞數量計算
活性單位定義:25℃中,每104個細胞每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。
PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T
=1608×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷細胞數量
(4)按血清(漿)體積計算
活性單位定義:25℃中,每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷V樣÷T
=1608×[(A3-A4)-(A1-A2)]
ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V總:反應體系總體積,0.2mL=2×10-4 L,V樣:加入反應體系中上清液體積,0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;Cpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量試劑盒;W :樣品質量; T:反應時間,1 min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1)按照蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。
PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(Cpr×V樣) ÷T
=3215×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
活性單位定義:25℃中,每克組織每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。
PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(W×V樣÷V樣總) ÷T
=3215×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷W
(3)按細胞數量計算
活性單位定義:25℃中,每104個細胞每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。
PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T
=3215×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷細胞數量
(4)按血清(漿)體積計算
活性單位定義:25℃中,每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷V樣÷T
=3215×[(A3-A4)-(A1-A2)]
ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光徑,0.5 cm;V總:反應體系總體積,0.2mL=2×10-4
L,V樣:加入反應體系中上清液體積,0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;Cpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量試劑盒;W :樣品質量; T:反應時間,1 min。
立即詢價
您提交后,專屬客服將第一時間為您服務