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總膽固醇(total cholesterol,TC)含量測定試劑盒說明書

閱讀:344      發(fā)布時(shí)間:2023-05-11
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總膽固醇(total cholesterolTC)含量測定試劑盒說明書

                                                   微量法100T/96S



   意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

TC包括游離膽固醇和膽固醇酯。TC是指組織中所有脂蛋白所含膽固醇之總和。

測定原理:

利用酯酶催化膽固醇酯水解生成游離膽固醇(FC)和游離脂肪酸(FFA),從而把膽固醇酯轉(zhuǎn)化為FC進(jìn)一步利用膽固醇氧化酶催化FC氧化,生成4-膽甾烯酮和H2O2;最后利用過氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替比林和酚,生成紅色醌類化合物;在500nm有特征吸收峰,其顏色深淺與TC含量成正比。

自備儀器和用品:

水浴鍋、可調(diào)式移液槍、酶標(biāo)儀、96孔板。

試劑組成和配置:

試劑一:異丙醇100mL(自備);

試劑二:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑三:粉劑×1瓶,4保存;

試劑四:液體40μL×1瓶,4保存;

TC標(biāo)準(zhǔn)品:液體1mL×1支,0.5μmol/mL4保存。

TC的提取:

1、組織中TC的提取:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿,8000g 4℃離心10min,取上清,即TC待測液。

2、細(xì)胞、細(xì)菌中TC的提取:先收集400-500萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,加1mL試劑一,超聲波破碎1min(強(qiáng)度20%,超聲2s,停1s,即TC待測液。

3、血清(漿)等樣品:直接測定。

測定操作:

1. /酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到500 nm

2. TC工作液的配制:臨用前,吸取約0.8mL試劑二分別加入試劑三和試劑四瓶中,充分溶解后再全部轉(zhuǎn)移回試劑二瓶中,充分混勻,TC工作液置于37水浴10min。用不完的工作液4℃保存一周。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:依次在96孔板中加入20μL FC標(biāo)準(zhǔn)液和180μL TC工作液,混勻,37℃靜置3h后于500nm測定A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測定管:依次在96孔板中加入20μL FC待測液和180μLTC工作液,混勻,37℃靜置3h500nm測定A測定管。

5. 空白管:依次在96孔板中加入20μL 試劑一180μLTC工作液,混勻,37℃靜置3h500nm測定A測定管。

注意:標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測定一次。

計(jì)算公式:

1. 血清(漿)中TC含量計(jì)算:

TCμ mol /dL=C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×100

=50×A測定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)液:0.5μmol/mL100 mL1dL=100 mL

2. 組織中TC含量計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

TCμ mol / mg prot= C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

   = 0.5×A測定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算

TCμ mol / g 鮮重= C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

   = 0.5×A測定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液:0.5μmol/mL樣本蛋白濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g/mL

3. 細(xì)胞、細(xì)菌中TC含量計(jì)算:

TCμ mol /104 cell=C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷細(xì)菌或細(xì)胞(104 cell /L

   =0.5×A測定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷細(xì)菌或細(xì)胞(104 cell /L

C標(biāo)準(zhǔn)液:0.5μmol/mL

Z低檢出限為1nmol/mL


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