甘油三酯(triglyceride, TG)含量測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
TG是長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子,不僅是細胞膜的主要成分,也是重要呼吸底物。
測定原理:
用異丙醇提取TG,脂蛋白酯酶水解TG生成甘油和脂肪酸(FFA),甘油與三磷酸腺苷在甘油激酶和磷酸甘油氧化酶催化下生成H2O2,過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯酚,生成有色化合物,在505 nm處有特征吸收峰。
自備儀器和用品:
酶標儀、臺式離心機、可調式移液槍、96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配置:
試劑一:液體120 mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體12 mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體12 mL×1瓶,4℃避光保存。
TG的提取:
1、 組織中TG的提?。喊凑战M織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即TG待測液。
2、細胞、細菌中TG的提?。合仁占?/span>400-500萬細胞或細菌到離心管內,離心后棄上清,加1mL試劑一,超聲波破碎1min(強度20%,超聲2s,停1s),8000g,4℃離心10min,取上清,即TG待測液。
3、血清(漿)樣品:直接測定。
測定操作:
酶標儀預熱30min,調節波長到505 nm。
試劑(μL) | 空白管 | 測定管 |
樣本 | 10 | |
試劑一 | 10 | |
試劑二 | 95 | 95 |
試劑三 | 95 | 95 |
混勻,室溫下靜置20min,于505 nm波長處讀取吸光值,記為A空白和A測定,△A=A測定-A空白??瞻坠苤恍铚y一管。
計算公式:
標準曲線:y = 0.3261x - 0.0199; R2 = 0.9979;x:標準品濃度(mg/mL) y:吸光值差值ΔA。
1. 血清(漿)中甘油三酯含量計算:
TG含量(mg/mL)=(ΔA+0.0199)÷ 0.3261=3.07×(ΔA+0.0199)
2. 組織、細菌或細胞中甘油三酯含量計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
TG含量(mg/ mg prot)= (ΔA+0.0199)÷0.3261×V樣÷(Cpr×V樣)=3.07×(ΔA+0.0199)÷Cpr
(2)按樣本質量計算
TG含量(mg/ g 鮮重)=(ΔA+0.0199)÷0.3261×V樣÷(W×V樣÷V樣總)=3.07×(ΔA+0.0199)÷ W
V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入試劑一體積,1 mL;W:樣本質量,g;
Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL。
注意事項:
1. 試劑盒中有易揮發性物質,實驗過程中需佩戴手套和口罩,試劑瓶蓋打開后應該及時蓋緊。
2. Z低檢出限為100μg/mL。
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