磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰膽堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應的一類酶的總稱，廣泛存在于高等動植物和細菌等多種生物體中，具有參與細胞脂質代謝、信號傳導、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。
測定原理：
磷脂酶D催化水解磷脂酰膽堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽堿，膽堿在膽堿氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過氧化氫，過氧化氫在過氧化氫酶的作用下將4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質，在500nm處有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器：
天平、研缽、超速冷凍離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體102mL×瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體3mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加1mL無水乙醇充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
試劑四：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。
標準品：液體1mL×1支，4℃避光保存。
酶液提取：
1. 組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
2. 細胞：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。
3. 血清：直接測定。
測定操作：
空白管 | 標準管 | 測定管 | |
試劑一（μL） | 20 | ||
試劑二（μL） | 30 | 30 | 30 |
標準品（μL） | 20 | ||
樣品（μL） | 20 | ||
試劑三（μL） | 10 | 10 | 10 |
充分混勻，30℃反應30min，沸水浴1min，打開蓋子，自然冷卻2min。 | |||
試劑四（μL） | 140 | 140 | 140 |
30℃反應30min，于微量石英比色皿/96孔板，空白管調零，測定500nm處吸光值，分別記為A標準管和A測定管。 | |||
酶活計算公式
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1．按照蛋白濃度計算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。
PLD活性（nmol/min /mg prot）= 
×C標準÷Cpr÷T= 16.7×÷Cpr
2．按照樣本質量計算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。
PLD活性（nmol/min /g 鮮重）= ×C標準÷W÷T = 16.7×÷W
3．按照細胞數量計算
酶活性定義：每104個細胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。
PLD活性（nmol/min /104 cell）= ×C標準÷細胞數量÷T = 16.7×÷細胞數量
4．按照液體體積計算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。
PLD活性（nmol/min /mL）= ×C標準÷T=16.7×
C標準：標準品濃度，500nmol/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g/mL；T：反應時間，30min
b. 用96孔板測定的計算公式如下
1．按照蛋白濃度計算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。
PLD活性（nmol/min /mg prot）= ×C標準÷Cpr÷T= 16.7×÷Cpr
2．按照樣本質量計算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。
PLD活性（nmol/min /g 鮮重）= ×C標準÷W÷T = 16.7×÷W
3．按照細胞數量計算
酶活性定義：每104個細胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。
PLD活性（nmol/min /104 cell）= ×C標準÷細胞數量÷T = 16.7×÷細胞數量
4．按照液體體積計算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產生1nmol膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。
PLD活性（nmol/min /mL）= ×C標準÷T=16.7×
C標準：標準品濃度，500nmol/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g/mL；T：反應時間，30min
注意事項：
1. 顯色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃離心5min后取上清測定。
2. 吸光值不宜超過1，否則用試劑一將酶液進行稀釋，并在計算公式中乘以稀釋倍數。
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