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羥甲基戊二酰輔酶A合成酶（HMGCS）試劑盒說明書

                                        微量法 100管/96樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

羥甲基戊二酰輔酶A合成酶是甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA。

測定原理：

HMGCS催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA，同時產(chǎn)生CoASH，使DTNB轉(zhuǎn)化為黃色的TNB，在412nm下有特征吸光值。

所需的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃避光保存；臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存；臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

試劑三：6mL×1瓶，4℃避光保存。

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   在微量石英比色皿或96孔板中加入25μL試劑一、25μL試劑二和50μL試劑三，混勻，加入100μL樣本上清，迅速混勻后記錄412nm下初始吸光值A1和4min后的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

HMGCS活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）活性

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣 ÷T=36.76×ΔA

2、組織、細菌或細胞HMGCS活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=36.76×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /10⁴ cel）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.074×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，4 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）活性

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣 ÷T=73.53×ΔA

2、組織、細菌或細胞HMGCS活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=73.53×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=73.53×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /10⁴ cel）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.147×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，4 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

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