線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100管/96樣
注 意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
ICDHm（EC 1.1.1.41）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，在三羧酸循中催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，同時(shí)將NAD+ 還原為NADH，是三羧酸循環(huán)的限速酶之一，其催化的反應(yīng)是細(xì)胞NADH主要來(lái)源之一。
測(cè)定原理：
ICDHm催化NAD+ 還原生成NADH，導(dǎo)致340nm處光吸收上升。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：20mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：1.5mL×1支，-20℃保存；
試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1支，4℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存;
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的ICDHm（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體ICDHm活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
（1）在試劑五中加入18mL試劑四充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（2）在試劑六中加入1mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑六和180μL試劑五，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
ICDHm活性計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V樣) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.65×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=650×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
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