甜菜堿（Betaine）含量試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
甜菜堿是一種廣泛分布于動植物及微生物體內的季銨型水溶性生物堿，是生物體內膽堿的氧化產(chǎn)物，可以增強免疫力、降血脂、抗氧化、抗腫瘤，并可作為甲基供體，參與促進動物蛋白質和脂肪代謝、增進食欲、緩和應激、調節(jié)滲透壓、穩(wěn)定維生素等多種生物作用，在化工、醫(yī)藥、食品添加劑等領域有較廣泛的應用。
測定原理：
甜菜堿在強酸條件下和雷氏鹽發(fā)生反應產(chǎn)生沉淀，沉淀用丙酮溶解形成紅色溶液，在525nm處有特征吸收峰，測定525nm處的吸光值，可計算得樣品的甜菜堿含量。
自備實驗用品及儀器：
天平、離心機、酶標儀、96孔板、yi醚、鹽酸、丙酮和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體30mL×1瓶 ，4℃保存；
試劑一：粉劑×3瓶，4℃保存；臨用前根據(jù)用量配制，每瓶加20mL蒸餾水溶解，加390μL濃鹽酸調pH為1。
試劑二：99%yi醚，自備。取無水yi醚59.4mL，加入蒸餾水0.6mL，混勻。
試劑三：70%丙酮，自備。（易揮發(fā)，根據(jù)用量自備，丙酮：蒸餾水=7:3）。
甜菜堿提取：
取烘干后過40目篩的樣品約0.02g，加0.8mL水，置于60℃提取30min，期間不斷震蕩。再加入200µL提取液，混勻后10000g，25℃，離心10min，取上清液。
測定操作表：
1、 酶標儀預熱30min，調節(jié)波長至525nm。
2、 操作表
空白管 | 測定管 | |
上清液（µL） | 300 | |
蒸餾水（µL） | 300 | |
試劑一（µL） | 500 | 500 |
充分混勻，4℃中反應2h，12000rpm，25℃，離心10min，棄上清 | ||
試劑二（µL） | 500 | 500 |
混勻，12000rpm，25℃，離心10min，棄上清。置于通風櫥使殘余yi醚自然揮發(fā)干凈 | ||
試劑三（µL） | 300 | 300 |
震蕩使沉淀充分溶解，取200µL于96孔板，記錄標準管和測定管525nm處吸光值A測定與A空白。ΔA=A測定管-A空白管。 | ||
甜菜堿含量計算公式：
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.502x + 0.0057，R2 = 0.9993；x為甜菜堿濃度（mg/mL），y為吸光值。
甜菜堿含量（mg/g 干重）=（ΔA-0.0057）÷ 0.502× V標準÷(V樣÷V樣總×W)
=1.99×（ΔA-0.0057）÷W
V標準：標準品體積，0.3mL；V樣：反應中樣本體積，0.3mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質量，g
注意事項：
1、 試劑一配制時pH嚴格控制為1，否則會導致反應不wan全，配制后4℃只能穩(wěn)定幾個小時，配制后盡快使用。
2、 試劑二與試劑三對呼吸道有一定的刺激，請做好防護工作。
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