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E14 小鼠胚胎干細胞說明書

閱讀:739      發(fā)布時間:2023-09-08
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小鼠胚胎干細胞

ES-E14TG2a

細胞描述:

小鼠胚胎干細胞。該細胞缺乏 HGPRT(HPRT),并且對 0.06 mM 的 6-硫鳥嘌呤有抗性。當(dāng)在飼養(yǎng)層(胚胎成纖維細胞或 STO 細胞)上培養(yǎng)時,細胞保持未分化狀態(tài)。在沒有飼養(yǎng)層的情況下,細胞自發(fā)分化并形成胚胎結(jié)構(gòu)。當(dāng)注入胚泡中時,細胞可以進入生殖系。在常規(guī)的分子基因修飾技術(shù)之后,它們可用于重構(gòu)小鼠胚胎。培養(yǎng)時需使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細胞。


細胞特性

1)  來源:小鼠,129/Ola品系,胚胎內(nèi)細胞團

2)  形態(tài):球形克隆 貼壁生長

3)  含量:>1x106  細胞數(shù)

4)  規(guī)格:1mL凍存管包裝

5)  用途:僅供科研使用

運輸和保存:干冰運輸:1mL凍存管包裝干冰運輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染,請立即與我們聯(lián)系。


一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備:

1)準備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基      81%

優(yōu)質(zhì)胎牛血清           15 %

GlutaMAX-1谷氨酰胺       1 %

MEM NEAA非必需氨基酸    1%

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉   1%

P/S青霉素-鏈霉素        1%

β-巰基乙醇       0.5 mL(1000X)

LIF                       5μg(10ng/mL)

使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細胞。

2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3)凍存液:完培養(yǎng)液 60%?,F(xiàn)BS 30%?,DMSO 10%?現(xiàn)用現(xiàn)配。

我?guī)靸龃鏁r,體積為 500 μl,預(yù)期存活率 70%,每支凍存管的細胞復(fù)蘇,3 至4 天后,會形成 30 至 40 個克隆,建議復(fù)蘇至 1 個 T25 培養(yǎng)瓶中。

二:細胞處理:

MEF 細胞鋪制:

1. 在 T25 培養(yǎng)瓶中加入 0.2%明膠,搖勻后覆蓋底面即可,于 37℃細胞培養(yǎng)箱至少放置 15 min 以上。

2. 吸除 0.2%明膠,加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完培養(yǎng)液。一般地,一個 T25 培養(yǎng)瓶中加入 5 ml MEF 完培養(yǎng)液。

3.  按實驗需要:小鼠胚胎干細胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF;復(fù)蘇 MEF 細胞若干支。將凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。

4. 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含 2 ml MEF 完培養(yǎng)液的 15 ml 離心管內(nèi),以1000 rpm,離心 5 min,離心后將上清液吸除,另加入新鮮的 MEF 完培養(yǎng)液 1 ml,重懸后按照一個 T25 培養(yǎng)瓶鋪 1?106 的 MEF 細胞,平均加入到 T25 培養(yǎng)瓶中,輕輕搖勻后置于 37℃細胞培養(yǎng)箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細胞。

5.復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細胞前,將 T25 培養(yǎng)瓶中的 MEF 完培養(yǎng)液吸除,加入 2 ml 小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除,加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液待用。

復(fù)蘇:

1.將小鼠胚胎干細胞凍存管從液氮中取出,置于 37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75?酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。

2. 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi),以 1000 rpm,離心 5 min。

3. 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液 2 ml,吹打懸浮。

4. 重復(fù)吹打,制成單細胞懸液,盡量避免氣泡。

5.  轉(zhuǎn)移至 1 個已經(jīng)鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液。

傳代:

1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代,視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液。

3. 用 PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶(含 EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動,使胰酶覆蓋底面,置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細胞。

5. 在顯微鏡下觀察,直至細胞層全部脫落(一般需要 1-2 min)。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液終止消化。

7.  以 1000 rpm,離心 5 min,棄上清。

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液,多次輕輕吹打細胞, 制成單細胞懸液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液,吹打混勻,細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地,一個 T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。

傳代比例:1:4-1:7

凍存:

1.按傳代的方法將細胞消化下來,制成細胞懸液。

2.  以 1000 rpm,離心 5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細胞。

3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。

4.將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過夜,轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方:

小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液 60%,ES 級 FBS 30%,DMSO 10%

附:小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞分離的簡易方法(差速貼壁法):

1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細胞,按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后,加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完培養(yǎng)液重懸細胞, 吹打混勻,細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶(一般地,一個T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞,在一個 10 cm 培養(yǎng)皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠,如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞)中。

2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時。

3.  1 小時后,絕大部分 MEF 細胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面,而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液,進行后續(xù)實驗。


注意事項:

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級生物安全臺內(nèi)操作,并請注意防護,所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意:凍存管浸沒在液氮中會泄漏,并會慢慢充滿液氮。解凍時,液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。



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