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丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)試劑盒說明書

閱讀:340      發(fā)布時間:2023-09-14
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丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)試劑盒說明書

                                          微量法100/96

    意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

丙酮酸磷酸雙激酶pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1C4途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶,催化ATP、丙酮酸和Pi經(jīng)三步反應(yīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于C4植物的葉綠體基質(zhì)中,對光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用。

 

測定原理:

PPDK的逆向反應(yīng)催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMPPPi生成丙酮酸、ATPPi,乳酸脫氫酶進一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,在340nm測定NADH減少速率,計算PPDK活性。

 

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體25 mL×1瓶, 4保存;

試劑二:粉劑×2瓶,-20保存;

試劑三 :液體40μL×1支,4保存;體積較少,若沾在管壁上,臨用前可低速離心后使用。

 

樣本的前處理:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟和加樣表:

1、   分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測定

1)工作液的配制:臨用前取試劑二一瓶加入10mL試劑一和5μL試劑三,充分混勻,置于37水浴5min用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液,混勻,立即記錄340nm初始吸光值A137℃反應(yīng)5min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2

 

PPDK活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDKnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

 

PPDKnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時間,5 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDKnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDKnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總)÷T=1286×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時間,5 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g


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