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二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒說明書

閱讀:321      發(fā)布時間:2023-09-14
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二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒說明書

                                   微量法100管/96樣

 

注    意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一個關鍵酶,既控制著CO2的固定,同時又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流,其活性的大小直接影響著光合速率。

 

測定原理:

在Rubisco的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)與1分子的CO2結合,產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通過外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用,產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸,并使還原型輔酶I(NADH)氧化。因此,340nm吸光度的變化可計算還原型輔酶I氧化速率,還原型輔酶I氧化速率可反應Rubisco的活性。

 

需自備的儀器和用品:

分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

提取液二:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:25mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入10mL試劑一,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入10mL試劑一,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

試劑四:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入1 mL試劑一,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

(注意:試劑二、三、四溶解后,按需分裝-20℃保存。)

 

粗酶液制備:

①總Rubisco酶提取:建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時間1min),然后4℃,8000g離心10min,取上清測定。

②胞漿和葉綠體Rubisco酶的分離:按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一),冰浴勻漿后于4℃,200g離心5min,棄沉淀,取上清在4℃,8000g離心10min,取上清用于測定胞漿Rubisco酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時間1min),然后4℃,8000g離心10min,取上清測定葉綠體中Rubisco酶活性。

建議測定總Rubisco酶活性,按照步驟①提取粗酶液,若需要分別測定胞漿和葉綠體中的Rubisco,則按照步驟②提取粗酶液。

(注意:粗酶液制備過程中超聲破碎操作使用細胞破碎儀進行。)

 

 

測定步驟:

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

(1)         工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三1:1混合,用多少配多少;

(2)         在微量石英比色皿或96孔板中加入10uL樣本、10uL試劑四和180uL工作液,混勻,立即記錄340nm處20s時吸光值A1和5min20s時的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。

 

Rubisco活性計算:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1、按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。

 Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr

此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度,建議選購本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。

2、按樣本鮮重計算

單位的定義:25℃中1 g組織1 min氧化1nmol NADH。

 Rubisco(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

上述計算公式中各符合含義:

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,5min;W:樣本質(zhì)量,g。

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下:

1、按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。

 Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr

此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度,建議選購本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。

2、按樣本鮮重計算

單位的定義:25℃中1 g組織1 min氧化1nmol NADH。

 Rubisco(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

上述計算公式中各符合含義:

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,5 min;W:樣本質(zhì)量,g。


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