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磷酸丙糖異構酶(Triose-phosphate isomerase,TPI) 試劑盒說明書

閱讀:317      發布時間:2023-09-14
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磷酸丙糖異構酶(Triose-phosphate isomeraseTPI

試劑盒說明書

                                                     微量法100T/96S

注   意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

植物葉綠體中磷酸丙糖異構酶是光合作用中參與calvin循環的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉化,磷酸二羥丙酮能快速透過葉綠體的包膜進入細胞質,并在其中逐步轉化為蔗糖。

 

測定原理:

磷酸丙糖異構酶將磷酸二羥丙酮轉化為3-磷酸甘油醛,3-磷酸甘油醛與NAD在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH,340nm處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構酶的活性的高低。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、研缽、震蕩儀、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板。

 

試劑組成和配制:

提取液一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

提取液二:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體12mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑三:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑四:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

 

酶液提取

①總TPI酶提取:建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時間1min),然后4℃,8000g離心10min,取上清測定。

②胞漿和葉綠體TPI酶的分離:按照植物組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一),冰浴勻漿后于4℃,200g離心5min,棄沉淀,取上清在4℃,8000g離心10min,取上清用于測定胞漿TPI酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時間1min),然后4℃,8000g離心10min,取上清測定葉綠體中TPI酶活性。

建議測定總TPI酶活性,按照步驟①提取粗酶液,若需要分別測定胞漿和葉綠體中的TPI,則按照步驟②提取粗酶液。

 

測定操作:

1.        分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2.        取微量石英比色皿/96孔板,依次加入120μL試劑一,20μL試劑二,20μL試劑三,20μL試劑四,20μL

 

3.        粗酶液,充分混勻,記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2,△A=A2-A1

 

計算公式:

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1)按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

TPI(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按照樣本質量計算

酶活單位定義:每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

TPI(nmol/min/g 鮮重)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反總:反應體系總體積,0.2mL;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g

 

b.       用96孔板測定的計算公式如下

(1)按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

TPI(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

(2)按照樣本質量計算

酶活單位定義:每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

TPI(nmol/min/g 鮮重)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

V反總:反應體系總體積,0.2mL;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g


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