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焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸轉移酶試劑盒說明書

閱讀:301      發布時間:2023-09-19
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焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸轉移酶(Pyrophosphate: fructose-6 – phosphate-1-phosphoric acid transferase,PFP)試劑盒說明書


                                                  微量法100T/96S

注    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸轉移酶(PFP,EC2.7.1.90)是一種胞質酶,廣泛存在于植物組織中,催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉化,在光合作用碳代謝中起重要作用。


測定原理:

PFP催化6-磷酸果糖轉化為1,6-二磷酸果糖,它在醛縮酶和磷酸丙糖異構酶的作用下轉變為3-磷酸甘油醛,再由3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH催化生成3-磷酸甘油酸、NAD和磷酸,340nm處的吸光度變化反映了PFP的活性的高低。


自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板。


試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑三:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑四:液體1mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑五:液體1mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑六:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。


酶液提取:

1.        組織:按照質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。

3.        液體:直接檢測。


測定操作:

1.        紫外分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2.        取微量石英比色皿/96孔板,依次加入100μL試劑一,20μL試劑二,20μL試劑三,10μL試劑四,10μL


試劑五,20μL試劑六,20μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2,△A=A1-A2


計算公式:

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1)按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按照樣本質量計算

酶活單位定義:每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP(nmol/min /g 鮮重)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

(3)按照細胞數量計算

酶活單位定義:每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP(nmol/min/104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細胞數量

(4)按照液體體積計算

酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP(nmol/min/mL)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總:反應體系總體積,0.2mL;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g


b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1)按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

(2)按照樣本質量計算

酶活單位定義:每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP(nmol/min /g 鮮重)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

(3)按照細胞數量計算

酶活單位定義:每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP(nmol/min /104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

= 643.08×ΔA÷細胞數量

(4)按照液體體積計算

酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷V樣÷T= 643.08×ΔA

V反總:反應體系總體積,0.2mL;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g



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