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土壤谷氨酰胺酶(solid-glutaminase, S- GLS) 活性測(cè)定試劑盒說明書

閱讀:306      發(fā)布時(shí)間:2023-09-20
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土壤谷氨酰胺酶(solid-glutaminase, S- GLS) 活性測(cè)定試劑盒說明書

                                            微量法 100/96

 

    意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

GLSEC 3.5.1.2存在于高等動(dòng)物和某些細(xì)菌以及植物根中,催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨,在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用,尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。

 

測(cè)定原理:

S-GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨,利用奈氏試劑檢測(cè)氨增加的速率,即可計(jì)算其酶活性。

需自備儀器和用品:

臺(tái)式離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、甲苯、冰和雙蒸水。

 

試劑組成和配制:

試劑一×1瓶,15 mL4 ℃保存;

試劑二×1瓶,40 mL,4 ℃保存;

試劑三×1瓶,60 mL,常溫保存;

試劑四×1瓶,5 mL,常溫保存;

試劑五×1瓶,3 mL,常溫保存;

試劑六×1瓶,3 mL,常溫避光保存。

 

測(cè)定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至420nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣品測(cè)定(在EP管中加入下列試劑):

試劑名稱(uL

測(cè)定管

對(duì)照管

樣本

0.1


甲苯

25

25

振蕩混勻,室溫放置15min

試劑一

100

100

試劑二

400

400

混勻,37℃水浴2 小時(shí)

試劑三

525

525

混勻,8000 g25℃離心10 min;取上清液,依次加入下列試劑

上清液

130

130

試劑四

30

30

試劑五

20

20

試劑六

20

20

混勻,室溫靜置15min,420nm處讀取測(cè)定管和對(duì)照管吸光值,

計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。對(duì)照管只要做一管。

 

注意:試劑六如出現(xiàn)沉淀,靜置后取上清使用。

 

酶活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 3.8488x+0.0057x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y吸光值A。

單位定義:每g土樣min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

 S-GLSnmol/min/g 土樣)=(ΔA-0.0057)÷3.8488×V反總÷W÷T=2.27×(ΔA -0.0057)÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積:1.05mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2h=120min;W:樣本質(zhì)量,g; 1000,μmolnmol換算系數(shù)。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.9244x+0.0057x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y吸光值A。

單位定義:每g土樣min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

 S-GLSnmol/min/g 土樣)=(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷W÷T=4.55×(ΔA -0.0057)÷W。

V反總:反應(yīng)體系總體積:0.525mLT:反應(yīng)時(shí)間,2h=120minW:樣本質(zhì)量,g; 1000,μmolnmol換算系數(shù)。


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