土壤亮氨酸氨基肽酶(Solid-Leucine Aminopeptidase,S- LAP)試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
S-LAP是一類能水解肽鏈N-末端為亮氨酸的酶,由土壤微生物分泌。S-LAP活性變化與機體某些病理狀態密切相關。
測定原理:
S-LAP分解L-亮氨酰對硝基苯胺生成對硝基苯胺,后者在405nm有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計算S-LAP活性。
自備用品:
酶標儀/可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、96孔板/微量石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體35mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;
S-LAP測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至405nm,蒸餾水調零。
2、 在試劑二瓶中加入15mL試劑一充分溶解(如較難溶解,可60℃水浴加熱約30min促進溶解);用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
3、 操作表
試劑名稱 | 對照管 | 測定管 |
新鮮土樣(g) | 0.05 | 0.05 |
試劑一(μL) | 300 | |
試劑二(μL) | 300 |
混勻, 37℃振蕩反應1h后,8000g 4℃離心10min,S-LAP活力單位的計算:
取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中,405nm處測定吸光值A,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管。
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
單位的定義:每天每g土樣每天生成1 μmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。
S-LAP(μmol/d /g 土樣)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷W÷T=14.8×ΔA
V反總:反應體系總體積,3×10-4 L;ε:對硝基苯胺摩爾消光系數,9.72×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,
1cm;T:反應時間,1h=1/24d; W:樣本質量,0.05g。
b.用96孔板測定的計算公式如下:
單位的定義:每天每g土樣每天生成1 μmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。
S-LAP(μmol/d /g 土樣)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷W÷T=29.6×ΔA
V反總:反應體系總體積,3×10-4 L;ε:對硝基苯胺摩爾消光系數,9.72×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,0.5cm;T:反應時間,1h=1/24d; W:樣本質量,0.05g。
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